Domuzların Sarnıç Magnasında Doğrudan Kanın İmplantasyonu
Summary
Bu makale, domuzların sarnıç magnasında doğrudan canül implantasyonu için adım adım bir protokol sunun.
Abstract
Glimfik sistem, beyin omurilik sıvısının (CSF) astrositlere bağlı pervasküler alanlarda akışına dayanan ve amiloid-beta gibi nörotoksik peptitlerin temizlenmesinde bulaşmış bir atık temizleme sistemidir. Bozulmuş glimfik fonksiyon, Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıkların hayvan modellerinde hastalık patolojisini şiddetlendirir ve bu da bu boşluk sistemini anlamanın önemini vurgular. Glimfik sistem genellikle sezgilerin doğrudan beyin omurilik sıvısına (CSF) teslim edildiği sarnıç magna cannülasyonları (CMc) tarafından incelenir. Bununla birlikte, çoğu çalışma kemirgenlerde yapılmıştır. Burada, domuzlarda CMc tekniğinin bir uyarlamasını gösteriyoruz. Domuzlarda CMc kullanılarak, glimfatik sistem jinekökenik beyinlerde yüksek optik çözünürlükte incelenebilir ve bunu yaparken kemirgen ve insan glimfatiği arasındaki bilgi boşluğunu kapatır.
Introduction
Beyin omurilik sıvısı (CSF), merkezi sinir sistemi (CNS)1,2 içinde ve çevresinde bulunan ultrafilt kandır. CSF, beyne yüzdürme vermenin veya zarar verici mekanik kuvvetleri emmenin yanı sıra, metabolik atıkların CNS3’ten temizlenmesinde de önemli bir rol oynar. Atık temizliği, CSF’nin beyin parankiminde pervasküler boşluklar (PVS) yoluyla konvektif akışına izin veren ve nüfuz eden arterleri çevreleyen yakın zamanda karakterize edilen glimfik sistem tarafından kolaylaştırılmıştır3,4,5. Bu işlemin, öncelikle astrositik endfeet üzerinde ifade edilen ve PVS4,6’ya bağlı bir su kanalı olan aquaporin-4’e (AQP4) bağlı olduğu gösterilmiştir. Glimfik sistemin çalışması, CSF7,8,9,10,11’e floresan/radyoaktif izleyici veya kontrast madde girmesini takiben gelişmiş ışık mikroskopisi veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak hem de vivo hem de ex vivo görüntüleme ile elde edilir.
Beyin parankiminde hasara yol etmeden CSF’ye bir izleyici sokmanın etkili bir yolu sarnıç magna kanülasyonundan (CMc)12,13’dür. Tüm glimfik çalışmaların büyük bir çoğunluğu, şimdiye kadar kemirgenlerde yapılmış ve CMc’nin istilacılığı ve küçük bir memeli ile çalışmanın pratik basitliği nedeniyle daha yüksek memelilerde kaçınılmıştır. Ek olarak, farelerin ince kafatasları, kafatası penceresine ihtiyaç duymadan in vivo görüntülemeye izin verir ve daha sonra karmaşık olmayan bir beyin ekstraksiyonuna izin verir11,14. İnsanlarda yapılan deneyler glimfatik fonksiyon hakkında değerli bir makroskopik in vivo veri elde etti, ancak distal lomber omurgadaki intratekal izleyici enjeksiyonlarına dayandı ve ayrıca glimfatik sistemi mikroanatomi yakalamak için yeterli çözünürlük vermeyen MRI’ı kullandı7,15,16 . Yüksek memelilerde glimfik sistemin mimarisini ve kapsamını anlamak, insanlara çevrilmesinde esastır. İnsanlara glimfik çeviriyi kolaylaştırmak için, kemirgenlerde gerçekleştirilen tekniklerin daha yüksek memelilere uygulanması önemlidir, böylece glimfik sistemin artan biliş ve beyin karmaşıklığı türleri arasında doğrudan karşılaştırılmasına izin vermek önemlidir17. Domuz ve insan beyinleri katlanmış bir nöroarşisitture sahip olan jinekfaliktir, kemirgen beyinleri ise lisensefaliktir, böylece birbirleri arasında önemli bir fark vardır. Genel boyut açısından, domuz beyinleri de, insan beyninden 10-15 kat daha küçükken, fare beyinleri 3.000 kat daha küçüktür18. Büyük memelilerde glimfik sistemi daha iyi anlayarak, inme, travmatik beyin hasarı ve nörodejenerasyon gibi durumlarda gelecekteki terapötik müdahale için insan glimfik sistemini kullanmak mümkün olabilir. Domuz in vivo doğrudan CMc, daha yüksek bir memelide glimfik sistemin yüksek çözünürlüklü ışık mikroskopisine izin veren bir yöntemdir. Ayrıca, kullanılan domuzların büyüklüğü nedeniyle, insan ameliyatlarında kullanılanlara benzer izleme sistemleri uygulamak mümkündür, bu da bunların glimfik işleve nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için hayati işlevleri sıkı bir şekilde belgelemeyi ve düzenlemeyi mümkün hale getirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, gerekli hazırlık, cerrahi prosedür, izleyici infüzyonu ve beynin çıkarılması da dahil olmak üzere domuzlarda sarnıç magnasının doğrudan kanülasyonunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu, büyük hayvanlarla çalışmak için deneyime ve sertifikaya sahip birini gerektirir. Doğru bir şekilde gerçekleştirilirse, bu, istenen moleküllerin doğrudan CSF’ye teslim edilmesine izin verir, bundan sonra büyük bir memelide CSF dağılımını ve glimfik fonksiyonu y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, Hjärnfonden, Wenner Gren Vakıfları ve Crafoord vakfı tarafından desteklendi.
Materials
| 0.01% azide in PBS | Sigmaaldrich | S2002 | |
| 18G needle | Mediq | ||
| 1ml Syringe | FischerSci | 15849152 | |
| 20G cannula | Mediq | NA | |
| 22G cannula | Mediq | NA | |
| 4% paraformaldehyde | Sigmaaldrich | P6148 | |
| Anatomical forceps | NA | NA | |
| Bovine serum albumin Alexa-Fluor 647 Conjugate | ThermoFischer | A34785 | 2 vials (10mg) |
| CaCl2 | Sigmaaldrich | C1016 | |
| Chisel | ClasOhlson | 40-8870 | |
| Dental cement | Agnthos | 7508 | |
| compact saw | ClasOhlson | 40-9517 | |
| Glucose | Sigmaaldrich | G8270 | |
| Hammer | ClasOhlson | 40-7694 | |
| Insta-Set CA Accelerator | BSI-Inc | BSI-151 | |
| IV line TAP, 3-WAYS with 10cm extension | Bbraun | NA | |
| KCl | Sigmaaldrich | P9333 | |
| Marker pen | NA | NA | |
| MgCl2 | Sigmaaldrich | M8266 | |
| MilliQ water | NA | NA | |
| NaCL | Sigmaaldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigmaaldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigmaaldrich | S5761 | |
| No. 20 scalpel blade | Agnthos | BB520 | |
| No. 21 Scalpel blade | Agnthos | BB521 | |
| No. 4 Scalpel handle | Agnthos | 10004-13 | |
| Saline | Mediq | NA | |
| Salmon knife | Fiskers | NA | |
| Self-retaining retractors | NA | NA | |
| Superglue | NA | NA | |
| Surgical curved scissors | NA | NA | |
| Surgical forceps | NA | NA | |
| Surgical towel clamps | NA | NA |
Referências
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Sakka, L., Coll, G., Chazal, J. Anatomy and physiology of cerebrospinal fluid. European Annals of Otorhinolaryngology, Head and Neck Diseases. 128 (6), 309-316 (2011).
- Nedergaard, M. Garbage truck of the brain. Science. 340 (6140), 1529-1530 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A Paravascular pathway facilitates csf flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid B. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the Adult Brain. Science. 342 (6156), 373-378 (2013).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. eLife. 7, 40070 (2018).
- Ringstad, G., et al. Brain-wide glymphatic enhancement and clearance in humans assessed with MRI. JCI Insight. 3 (13), 121537 (2018).
- Lundgaard, I., Wang, W., Eberhardt, A., Vinitsky, H. S., Cameron, B. Beneficial effects of low alcohol exposure, but adverse effects of high alcohol intake on glymphatic function. Scientific Reports. , 1-16 (2018).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B is required for development of the glymphatic system. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (20), 1-15 (2018).
- Bechet, N. B., et al. Light sheet fluorescence micrscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), e57378 (2018).
- Ramos, M., et al. Cisterna magna injection in rats to study glymphatic function. Methods in Molecular Biology. 1938, (2019).
- Sweeney, A. M., et al. in vivo imaging of cerebrospinal fluid transport through the intact mouse skull using fluorescence macroscopy. Journal of visualized experiments. (149), e59774 (2019).
- Eide, P. K., Ringstad, G. MRI with intrathecal MRI gadolinium contrast medium administration: A possible method to assess glymphatic function in human brain. Acta Radiologica Open. 4 (11), 205846011560963 (2015).
- Ringstad, G., Vatnehol, S. A. S., Eide, P. K. Glymphatic MRI in idiopathic normal pressure hydrocephalus. Brain. 140 (10), 2691-2705 (2017).
- Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
- Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic function in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2021).
- Raghunandan, A., et al. Bulk flow of cerebrospinal fluid observed in periarterial spaces is not an artifact of injection. bioRxiv. , (2020).
- D’Angelo, A., et al. Spinal fluid collection technique from the atlanto-occipital space in pigs. Acta Veterinaria Brno. 78 (2), 303-305 (2009).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), 5447 (2019).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Pleticha, J., et al. Pig lumbar spine anatomy and imaging-guided lateral lumbar puncture: A new large animal model for intrathecal drug delivery. Journal of Neuroscience Methods. 216 (1), 10-15 (2013).
