Här beskriver vi hur man använder de automatiserade makromolekylära kristallografiledningarna för protein-till-struktur, snabb ligand-proteinkomplexanalys och storskalig fragmentscreening baserad på CrystalDirect-tekniken vid HTX Laboratory i EMBL Grenoble.
EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), en storskalig användaranläggning som erbjuder kristallografitjänster med hög genomströmning till användare över hela världen. HTX-labbet har ett starkt fokus på utveckling av nya metoder inom makromolekylär kristallografi. Genom kombinationen av en kristalliseringsplattform med hög genomströmning, CrystalDirect-tekniken för helautomatisk kristallmontering och kryokylning och CRIMS-programvaran har vi utvecklat helautomatiska rörledningar för makromolekylär kristallografi som kan fjärrstyras via internet. Dessa inkluderar en protein-till-struktur pipeline för bestämning av nya strukturer, en pipeline för snabb karakterisering av protein-ligand komplex till stöd för medicinsk kemi, och en storskalig, automatiserad fragment screening pipeline möjliggör utvärdering av bibliotek av över 1000 fragment. Här beskriver vi hur du kommer åt och använder dessa resurser.
Automatisering har införts i alla steg i den makromolekylära kristallografi experimentella processen, från kristallisering till diffraktionsdata insamling och bearbetning1,2,3,4,5,6,7,8,9, inklusive ett antal tekniker för provmontering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Detta har inte bara påskyndat den takt i vilken kristallografiska strukturer erhålls utan har bidragit till att effektivisera applikationer som strukturstyrd läkemedelsdesign18,19,20,21,22,23,24. I detta manuskript beskriver vi några av aspekterna av de automatiserade kristallografipipelines som finns tillgängliga på HTX-labbet i Grenoble samt den underliggande tekniken.
HTX-labbet på EMBL Grenoble är en av de största akademiska anläggningarna för kristalliseringsscreening i Europa. Det är samlokalt på European Photon and Neutron (EPN) campus tillsammans med European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), som producerar några av världens mest briljanta röntgenstrålar och Institut Laue Langevin (ILL), som tillhandahåller högflöde neutronstrålar. Sedan starten av verksamheten 2003 har HTX-labbet tillhandahållit tjänster till över 800 forskare och bearbetar mer än 1000 prover per år. HTX-labbet har ett starkt fokus på utveckling av nya metoder inom makromolekylär kristallografi, inklusive metoder för provutvärdering och kvalitetskontroll25,26 och CrystalDirect-tekniken, vilket möjliggör helautomatisk kristallmontering och bearbetning15,16,17. HTX-labbet har också utvecklat Crystallographic Information Management System (CRIMS), ett webbaserat laboratorieinformationssystem som tillhandahåller automatiserad kommunikation mellan kristallisering och synkrotrondatainsamlingsanläggningar, vilket möjliggör oavbrutet informationsflöde under hela provcykeln från rent protein till diffraktionsdata. Genom kombinationen av kapaciteten hos HTX-anläggningen, CrystalDirect-tekniken och CRIMS-programvaran har vi utvecklat helautomatiska protein-till-struktur-rörledningar som integrerar kristalliseringsscreening, kristalloptimering, automatiserad kristallskördningsbehandling och kryokylning och röntgendatainsamling vid flera synkrotroner till ett enda och kontinuerligt arbetsflöde som kan fjärrstyras via en webbläsare. Dessa rörledningar kan tillämpas för att stödja snabb bestämning av nya strukturer, karakterisering av protein-ligand komplex och storskalig förenings- och fragmentscreening genom röntgenkristallografi.
HTX-labbet är utrustat med en icke-kristalliseringsrobot (inklusive en LCP-modul som möjliggör kristallisering av både lösliga proteiner och membranproteiner), kristallfarmer (vid 5 °C och 20 °C), två robotiska vätskehanteringsstationer för att förbereda kristalliseringsskärmar och två automatiserade CrystalDirect-kristallskördare med kapacitet att producera och lagra upp till 400 frysta provstift per driftscykel. Forskare skickar sina prover till anläggningen med expresskurir, som sedan bearbetas av dedikerade tekniker på HTX-labbet. Forskare kan fjärrdesigna kristalliseringsscreenings- och optimeringsexperiment genom ett webbgränssnitt som tillhandahålls av CRIMS-systemet. Genom detta gränssnitt kan de välja mellan ett brett spektrum av parametrar och experimentella protokoll som finns tillgängliga på anläggningen för att passa deras specifika provkrav. Resultaten tillsammans med alla experimentella parametrar görs tillgängliga för användare i realtid via CRIMS. Alla mottagna prover analyseras genom en särskilt utvecklad metod som gör det möjligt att uppskatta kristalliserings sannolikheten för provet25,26,27. Baserat på resultaten av denna analys görs specifika rekommendationer till användare om optimal inkubationstemperatur och möjliga provoptimeringsexperiment. När kristalliseringsexperiment har ställts in kan forskare utvärdera resultaten genom att titta på kristalliseringsbilder som samlats in vid olika tidpunkter via webben. När kristaller som är lämpliga för röntgendiffraktionsexperiment identifieras kan forskare använda ett dedikerat gränssnitt för att upprätta en kristallmonteringsplan som sedan kommer att utföras av CrystalDirect-roboten.
CrystalDirect-tekniken är baserad på användningen av en modifierad mikroplatta för kristallisering av ångdiffusion och en laserstråle för att montera och kryokyla kristallprover i diffraktionskompatibla stöd för att stänga automatiseringsgapet mellan kristallisering och datainsamling15,16,17. Kortfattat odlas kristaller i en modifierad ångdiffusionsplatta, CrystalDirect-mikroplattan. När kristallerna dyker upp applicerar CrystalDirect-skörderoboten automatiskt en laserstråle för att ta bort ett filmstycke som innehåller kristallen, fäst det på en vanlig datainsamlingsstift och kryokyl den i en kvävegasström (se Zander et al. 2016 och https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denna teknik har ett antal ytterligare fördelar jämfört med manuella eller halvautomatiska kristallmonteringsprotokoll. Till exempel är kristallernas storlek och form inte ett problem, vilket gör det lika enkelt att skörda stora kristaller eller mikrokristaller, det är ofta möjligt att undvika användning av kryoskyddsmedel, på grund av det speciella sättet på vilket tekniken fungerar (se referens 17, Zander et al.), vilket gör röntgendiffraktionsanalys mycket enklare. Laserstrålen kan också användas som ett kirurgiskt verktyg för att välja de bästa delarna av ett prov när kristaller växer på kluster eller visar epitaxial tillväxt till exempel. CrystalDirect-tekniken kan också användas för automatiserade blötläggningsexperiment17. Leverans av lösningar med små molekyler eller andra kemikalier till kristaller. På så sätt kan det stödja helautomatisk, storskalig förenings- och fragmentscreening. När kristaller har skördats och kryokylts av CrystalDirect-roboten överförs de till antingen SPINE- eller Unipuck-puckar som är kompatibla med de flesta synkron makromolekylära kristallografistrålar runt om i världen. Systemet kan skörda upp till 400 stift (kapaciteten hos den kryogena lagringen Dewar) på ett helt autonomt sätt. CRIMS kommunicerar med skördarroboten under processen och ger automatiserad spårning av kristallprover (puckar och stift). Puckar är märkta med både streckkoder och RFID-taggar för att underlätta provhantering21,28.
CRIMS tillhandahåller ett API (Application Program Interface) som stöder automatiserad kommunikation med ISPyB-systemet som stöder hantering och bearbetning av röntgendata vid många synkrotroner i Europa och världen29. När den automatiska kristallskörden är klar kan forskare välja kristallprover (puckar) och skapa provsändningar för de makromolekylära kristallografistrålarna vid antingen ESRF (Grenoble, Frankrike)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS överför data som motsvarar de valda strållinjeproverna till synkrotroninformationssystemet tillsammans med förvalda parametrar för datainsamling. När proverna anländer till den valda synkrotronstrålelinjen utförs insamlingen av röntgendata antingen manuellt, genom fjärrövervakning eller på ett helt automatiserat sätt (dvs. vid MASSIF-1-strållinjen i ESRF8 som drivs av den gemensamma EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Efter datainsamling hämtar CRIMS automatiskt information om resultaten av datainsamlingen tillsammans med de första databehandlingsresultaten som utförs av synkrotrondatabehandlingssystemen och presenterar den för forskaren genom ett bekvämt användargränssnitt.
HTX-labbet tillämpar dessa automatiserade rörledningar för att stödja tre olika applikationer, snabba bestämningar av nya strukturer, snabb karakterisering av protein-ligand-komplex och storskalig förenings- och fragmentscreening. Nedan beskriver vi hur du använder och använder dem.
De automatiserade kristallografipipelines som beskrivs här är tillgängliga för forskare över hela världen genom olika finansieringsprogram. För närvarande kan finansierad åtkomst för kristalliseringsexperiment och CrystalDirect-tekniken erhållas genom att ansöka till iNEXT Discovery-programmet och INSTRUCT-ERIC, medan tillgång till makromolekylära kristallografiska strålar vid ESRF stöds genom ESRF-användaråtkomstprogrammet. Detta tillvägagångssätt minimerar fördröjningen mellan kristalltillväxt och mätning, påskyndar utvecklingen av mycket utmanande projekt som kräver diffraktionsbaserad optimering av proteinproduktions- och kristalliseringsförhållanden och befriar forskare från komplexa operationer i samband med kristallisering, kristallhantering och strållinjedrift, vilket gör kristallografi mer tillgänglig för icke-expertgrupper. Det kan också användas för snabb utforskning av kristalliseringstillsatser, fasningsmedel eller för sammansatt screening genom samkristalliseringsexperiment. Även om de flesta kristallografiprojekt potentiellt kan dra nytta av detta tillvägagångssätt, kan vissa prover kräva speciella protokoll som inte är mottagliga för automatisering eller de rörledningar som presenteras här, till exempel de som kräver mikrofluidiska system eller högspecialiserade kristalliseringsenheter eller prover som är extremt labila och inte tolererar leverans.
CrystalDirect-tekniken möjliggör också automatiserad kristall blötläggning17 för karakterisering av små molekylmålkomplex. För detta skapas en liten bländare med lasern före skördeprocessen och en droppe av en lösning som innehåller önskade kemikalier (dvs fasningsmedel eller potentiella ligands) läggs ovanpå, så att den kommer i kontakt med och sprider sig till kristalliseringslösningen så småningom når kristallen. Kemiska lösningar kan formuleras i vatten, DMSO eller andra organiska lösningsmedel. Efter en viss inkubationstid kan kristallerna skördas och analyseras genom diffraktion enligt beskrivningen ovan. Detta tillvägagångssätt har tillämpats på snabb karakterisering av ligand-protein komplex i samband med strukturbaserad läkemedelsdesign samt på storskalig förening och fragment screening. I det senare fallet kan fragmentbibliotek med hundratals till över tusen fragment snabbt analyseras. Specifika CRIMS-gränssnitt som inte presenteras här underlättar design och automatiserad spårning av kristall blötläggningsexperiment, medan integration mellan CRIMS-programvaran och Pipedream-programvarusviten, utvecklad av Global Phasing Ltd (Storbritannien) möjliggör automatiserad databehandling, fasning, ligandidentifiering och strukturförfining över hundratals datamängder parallellt, vilket effektiviserar dataanalys och tolkning32,33 . Till exempel tillämpades denna pipeline nyligen på identifiering av fragment som binder både till den aktiva platsen och flera allosteriska platser i Trypanosoma brucei farnesyl pyrofosfatsyntas, ett nyckelenzym i parasiten som orsakar mänskliga afrikanska trypanosomiasis.
De pipelines som presenteras här kan bidra till att påskynda upptäcktstakten inom strukturbiologin och göra makromolekylär kristallografi mer tillgänglig för ett större antal forskargrupper. Genom att underlätta storskalig screening av föreningar och fragment kan de dessutom bidra till att främja translationell forskning och påskynda processen för läkemedelsupptäckt, vilket bidrar till att underlätta utvecklingen av bättre och säkrare läkemedel mot ett större antal mål.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka den gemensamma EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) för stöd i användningen och driften av ESRF makromolekylära strållinjer. Vi är tacksamma mot Matthew Bowler för stöd med datainsamling vid MASSIF-1-strållinjen i ESRF och Thomas Schneider och EMBL Hamburg Team för utmärkt stöd med datainsamling på P14 av PetraIII synkrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-skördaren är utvecklad i samarbete med Instrumentation Team på EMBL Grenoble. Detta projekt stöddes av finansiering från Europeiska gemenskapensH2020-program inom ramen för projekten iNEXT (Grant No 653706) och iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes genom Booster-programmet.
CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |