Здесь мы описываем, как использовать автоматизированные макромолекулярные кристаллографические конвейеры для анализа белково-структурного, быстрого анализа лиганд-белкового комплекса и крупномасштабного скрининга фрагментов на основе технологии CrystalDirect в лаборатории HTX в EMBL Гренобле.
EMBL Grenoble управляет Лабораторией кристаллизации высокой пропускной способности (HTX Lab), крупномасштабным пользовательским объектом, предлагающим высокопроизводительный кристаллографический сервис для пользователей по всему миру. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии. Благодаря сочетанию высокопроизводительной платформы кристаллизации, технологии CrystalDirect для полностью автоматизированного монтажа и криокоирования кристаллов и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы для макромолекулярной кристаллографии, которые могут удаленно управляться через Интернет. К ним относятся конвейер «белок-структура» для определения новых структур, конвейер для быстрой характеристики белково-лигандных комплексов в поддержку медицинской химии и крупномасштабный автоматизированный конвейер скрининга фрагментов, позволяющий оценить библиотеки из более чем 1000 фрагментов. Здесь мы расскажем, как получить доступ к этим ресурсам и использовать их.
Автоматизация внедрена на всех этапах экспериментального процесса макромолекулярной кристаллографии, от кристаллизации до сбора и обработки дифракционных данных1,2,3,4,5,6,7,8,9,включая ряд технологий монтажа образцов10,11,12 ,13,14,15,16,17. Это не только ускорило темпы получения кристаллографических структур, но и способствовало упорядочению приложений, таких как структурно-управляемый дизайн лекарств18,19,20,21,22,23,24. В этой рукописи мы описываем некоторые аспекты автоматизированных кристаллографических конвейеров, доступных в лаборатории HTX в Гренобле, а также базовые технологии.
Лаборатория HTX в EMBL Grenoble является одним из крупнейших академических учреждений для скрининга кристаллизации в Европе. Он расположен в европейском кампусе фотонов и нейтронов (EPN) вместе с Европейской установкой синхротронного излучения (ESRF), которая производит некоторые из самых ярких рентгеновских лучей в мире, и Институтом Лауэ Ланжевена (ILL), который обеспечивает пучки нейтронов с высоким потоком. С момента начала работы в 2003 году лаборатория HTX оказала услуги более чем 800 ученым и обрабатывает более 1000 образцов в год. Лаборатория HTX уделяет большое внимание разработке новых методов в макромолекулярной кристаллографии, включая методы оценки образцов и контроля качества25,26 и технологию CrystalDirect, позволяющую полностью автоматизировать монтаж и обработку кристаллов15,16,17. Лаборатория HTX также разработала Систему управления кристаллографической информацией (CRIMS), веб-систему лабораторной информации, которая обеспечивает автоматизированную связь между средствами кристаллизации и сбора синхротронных данных, обеспечивая непрерывный поток информации в течение всего цикла выборки от чистого белка до дифракционных данных. Благодаря сочетанию мощностей установки HTX, технологии CrystalDirect и программного обеспечения CRIMS мы разработали полностью автоматизированные трубопроводы от белка к структуре, объединяющие кристаллизационное скрининг, оптимизацию кристаллов, автоматизированную обработку сбора кристаллов и криокооление и сбор рентгеновских данных на нескольких синхротронах в единый и непрерывный рабочий процесс, которым можно удаленно управлять через веб-браузер. Эти трубопроводы могут быть применены для поддержки быстрого определения новых структур, характеристик белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов с помощью рентгеновской кристаллографии.
Лаборатория HTX оснащена необъемным кристаллизационным роботом (включая модуль LCP, который позволяет кристаллизировать как растворимые, так и мембранные белки), кристаллическими фермами (при 5 °C и 20 °C), двумя роботизированными станциями обработки жидкости для подготовки кристаллизационных экранов и двумя автоматизированными кристаллоуборочными комбайнами CrystalDirect с возможностью производства и хранения до 400 замороженных образцов штифтов за рабочий цикл. Ученые отправляют свои образцы на объект экспресс-курьером, которые затем обрабатываются специальными техниками в лаборатории HTX. Ученые могут удаленно проектировать эксперименты по скринингу кристаллизации и оптимизации через веб-интерфейс, предоставляемый системой CRIMS. Благодаря этому интерфейсу они могут выбирать из широкого спектра параметров и экспериментальных протоколов, доступных на объекте, в соответствии с их конкретными требованиями к образцам. Результаты вместе со всеми экспериментальными параметрами предоставляются пользователям в режиме реального времени через CRIMS. Все полученные образцы анализируются с помощью специально разработанного метода, позволяя оценить вероятность кристаллизации образца25,26,27. На основе результатов этого анализа пользователям даются конкретные рекомендации относительно оптимальной температуры инкубации и возможных экспериментов по оптимизации образцов. Как только эксперименты по кристаллизации установлены, ученый может оценить результаты, глядя на изображения кристаллизации, собранные в разные моменты времени через Интернет. Когда кристаллы, подходящие для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей, идентифицированы, ученые могут использовать специальный интерфейс для создания плана монтажа кристаллов, который затем будет выполнен роботом CrystalDirect.
Технология CrystalDirect основана на использовании модифицированной микропластины кристаллизации паровой диффузии и лазерного луча для монтажа криоохладимых кристаллических образцов в дифракционно-совместимые средства, закрывающие зазор автоматизации, существующий между кристаллизацией и сбором данных15,16,17. Вкратце, кристаллы выращиваются в модифицированной пародиффузионной пластине, микропластине CrystalDirect. Как только появляются кристаллы, робот для сбора данных CrystalDirect автоматически применяет лазерный луч, чтобы иссечь кусок пленки, содержащий кристалл, прикрепить его к стандартному штифту сбора дифракционных данных и криохлаждать его в потоке газообразного азота (см. Zander et al. 2016 и https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). Эта технология имеет ряд дополнительных преимуществ по сравнению с ручными или полуавтоматическими протоколами монтажа кристаллов. Например, размер и форма кристаллов не являются проблемой, что делает одинаково легким сбор крупных кристаллов или микрокристаллов, часто можно избежать использования криопротекторов, из-за особого способа, которым работает технология (см. ссылку 17, Zander et al.), что делает рентгеновский дифракционный анализ гораздо более простым. Лазерный луч также может быть использован в качестве хирургического инструмента для отбора лучших частей образца, когда кристаллы растут на кластерах или показывают эпитаксиальный рост, например. Технология CrystalDirect также может быть использована для автоматизированных экспериментов по замачивания17. Доставка растворов с малыми молекулами или другими химическими веществами к кристаллам. Таким образом, это позволяет поддерживать полностью автоматизированный, крупномасштабный скрининг соединений и фрагментов. После того, как кристаллы собраны и криокоолены роботом CrystalDirect, они передаются либо в SPINE, либо в Unipuck шайбы, которые совместимы с большинством синхронных макромолекулярных кристаллографических лучей по всему миру. Система может собирать до 400 штифтов (емкость криогенного хранилища Дьюара) полностью автономным образом. CRIMS взаимодействует с роботом-харвестером во время процесса и обеспечивает автоматическое отслеживание образцов кристаллов (шайб и штифтов). Шайбы маркируются как штрих-кодами, так и RFID-метками для облегчения управления образцами21,28.
CRIMS предоставляет интерфейс прикладной программы (API), поддерживающий автоматизированную связь с системой ISPyB, поддерживающей управление сбором и обработку рентгеновских данных на многих синхротронах в Европе и мире29. После завершения автоматизированного сбора кристаллов ученые могут отбирать образцы кристаллов (шайбы) и создавать партии образцов для макромолекулярных кристаллографических лучевых линий на синхротронах ESRF (Гренобль, Франция)7,8,9 или Петра III (Гамбург, Германия)18,19. CRIMS передают данные, соответствующие выбранным образцам лучевой линии, в синхротронную информационную систему вместе с предварительно выбранными параметрами сбора данных. Как только образцы поступают на выбранную линию синхротронного пучка, сбор рентгеновских данных осуществляется либо вручную, либо с помощью дистанционного управления лучевой линией, либо полностью автоматизированным способом (т.е. на линии пучка MASSIF-1 ESRF8, управляемой совместной объединенной группой структурной биологии EMBL ESRF (JSBG)). После сбора данных CRIMS автоматически извлекает информацию о результатах сбора данных вместе с исходными результатами обработки данных, осуществляемой системами синхротронной обработки данных, и представляет ее ученому через удобный пользовательский интерфейс.
Лаборатория HTX применяет эти автоматизированные конвейеры для поддержки трех различных применений: быстрого определения новых структур, быстрой характеристики белково-лигандных комплексов и крупномасштабного скрининга соединений и фрагментов. Ниже мы опишем, как их использовать и эксплуатировать.
Автоматизированные кристаллографические конвейеры, описанные здесь, доступны исследователям по всему миру через различные программы финансирования. В настоящее время финансируемый доступ для экспериментов по кристаллизации и технологии CrystalDirect можно получить, обратившись к программе iNEXT Discovery и INSTRUCT-ERIC, в то время как доступ к макромолекулярным кристаллографическим лучевым линиям в ESRF поддерживается через программу доступа пользователей ESRF. Этот подход сводит к минимуму задержку между ростом кристаллов и измерением, ускоряя прогрессирование очень сложных проектов, требующих дифракционной оптимизации условий производства и кристаллизации белка, и освобождает ученых от сложных операций, связанных с кристаллизацией, обработкой кристаллов и работой с лучевой линией, делая кристаллографию более доступной для неэкспертных групп. Он также может быть использован для быстрого исследования кристаллизационных добавок, фазовых агентов или для скрининга соединений с помощью экспериментов по кокристаллизации. В то время как большинство проектов кристаллографии потенциально могут извлечь выгоду из этого подхода, для некоторых образцов могут потребоваться специальные протоколы, не поддающиеся автоматизации или представленным здесь трубопроводам, например, те, которые требуют микрофлюидных систем или узкоспециализированных устройств кристаллизации или образцов, которые являются чрезвычайно лабильными и не допускают транспортировки.
Технология CrystalDirect также позволяет автоматизировать замачивание кристаллов17 для характеристики комплексов малых молекул-мишеней. Для этого лазером создается небольшое отверстие перед процессом сбора урожая и сверху добавляется капля раствора, содержащего желаемые химические вещества (т.е. фазовые агенты или потенциальные лиганды), так что он вступает в контакт и диффундирует в кристаллизационный раствор, в конечном итоге достигая кристалла. Химические растворы могут быть сформулированы в воде, ДМСО или других органических растворителях. После определенного времени инкубации кристаллы могут быть собраны и проанализированы дифракционным путем, как описано выше. Этот подход был применен к быстрой характеристике лиганд-белковых комплексов в контексте структурно-ориентированного лекарственного дизайна, а также к крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов. В последнем случае можно быстро проанализировать библиотеки фрагментов с сотнями и более чем тысячей фрагментов. Конкретные интерфейсы CRIMS, не представленные здесь, облегчают проектирование и автоматическое отслеживание экспериментов по замачинию кристаллов, в то время как интеграция между программным обеспечением CRIMS и пакетом программного обеспечения Pipedream, разработанным Global Phasing Ltd (Великобритания), позволяет автоматизировать обработку данных, фазирование, идентификацию лигандов и уточнение структуры сотен наборов данных параллельно, оптимизируя анализ и интерпретацию данных32,33 . Например, этот конвейер был недавно применен для идентификации фрагментов, связывающих как с активным сайтом, так и с несколькими аллостерическими участками Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase, ключевого фермента паразита, вызывающего африканский трипаносомоз человека.
Представленные здесь конвейеры могут способствовать ускорению темпов открытий в структурной биологии и сделать макромолекулярную кристаллографию более доступной для большего числа исследовательских групп. Кроме того, способствуя крупномасштабному скринингу соединений и фрагментов, они могут способствовать трансляционным исследованиям и ускорению процесса открытия лекарств, способствуя разработке более совершенных и безопасных лекарств против большего числа мишеней.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотим поблагодарить совместную группу структурной биологии EMBL-ESRF (JSBG) за поддержку в использовании и эксплуатации макромолекулярных лучевых линий ESRF. Мы благодарны Мэтью Боулеру за поддержку в сборе данных на линии луча MASSIF-1 ESRF и Томасу Шнайдеру и команде EMBL Hamburg за отличную поддержку в сборе данных на P14 синхротрона PetraIII (DESY, Гамбург, Германия). Комбайн CrystalDirect разработан в сотрудничестве с командой приборов EMBL Grenoble. Этот проект был поддержан финансированием программы Европейского сообщества H2020 в рамках проектов iNEXT (грант No 653706) и iNEXT Discovery (грант No 871037), а также Région Auvergne-Rhône-Alpes через программу Booster.
CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |