Her beskriver vi, hvordan du bruger de automatiserede makromolekylær krystallografirørledninger til protein-til-struktur, hurtig ligandprotein kompleks analyse og storskala fragmentscreening baseret på CrystalDirect-teknologien på HTX Laboratory i EMBL Grenoble.
EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), en storstilet brugerfacilitet, der tilbyder høj gennemløb krystallografi tjenester til brugere over hele verden. HTX laboratoriet har et stærkt fokus i udviklingen af nye metoder inden for makromolekylære krystallografi. Gennem kombinationen af en høj gennemløb krystallisering platform, CrystalDirect teknologi til fuldautomatisk krystal montering og kryokooling og CRIMS software, vi har udviklet fuldautomatiske rørledninger til makromolekylær krystallografi, der kan fjernstyres over internettet. Disse omfatter en protein-til-struktur-rørledning til bestemmelse af nye strukturer, en rørledning til hurtig karakterisering af protein-ligand-komplekser til støtte for medicinsk kemi og en storstilet, automatiseret fragmentscreeningspipeline, der gør det muligt at evaluere biblioteker med over 1000 fragmenter. Her beskriver vi, hvordan du får adgang til og bruger disse ressourcer.
Automatisering er blevet indført på alle trin i den makromolekylære krystallografi eksperimentelle proces, fra krystallisering til diffraktion dataindsamling og behandling1,2,3,4,5,6,7,8,9, herunder en række teknologier til prøve montering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Dette har ikke kun fremskyndet det tempo, hvormed krystallographic struktureropnås,men har bidraget til at strømline applikationer som strukturstyret lægemiddeldesign18,19,20,21,22,23,24. I dette manuskript beskriver vi nogle af de aspekter af de automatiserede krystallografirørledninger, der er tilgængelige på HTX-laboratoriet i Grenoble samt de underliggende teknologier.
HTX-laboratoriet på EMBL Grenoble er en af de største akademiske faciliteter til udkrystalaliseringsscreening i Europa. Det er co-placeret på European Photon and Neutron (EPN) campus sammen med den europæiske Synkrotron Radiation Facility (ESRF), som producerer nogle af verdens mest strålende røntgenstråler og Institut Laue Langevin (ILL), som giver høje flux neutronstråler. Siden starten af operationer i 2003 har HTX-laboratoriet leveret tjenester til over 800 forskere og behandler mere end 1000 prøver om året. HTX-laboratoriet har et stærkt fokus på udvikling af nye metoder inden for makromolekylær krystallografi, herunder metoder til prøveevaluering ogkvalitetskontrol 25,26 og CrystalDirect-teknologien, der muliggør fuldautomatisk krystalmontering og -behandling15,16,17. HTX-laboratoriet har også udviklet Crystallographic Information Management System (CRIMS), et webbaseret laboratorieinformationssystem, der giver automatiseret kommunikation mellem krystallisering og synkrotron dataindsamlingsfaciliteter, hvilket muliggør uafbrudt informationsflow over hele prøvecyklussen fra rene protein- til diffraktionsdata. Gennem kombinationen af kapaciteten i HTX-anlægget, CrystalDirect-teknologien og CRIMS-softwaren har vi udviklet fuldautomatiske protein-til-struktur-rørledninger, der integrerer krystalliseringsscreening, krystaloptimering, automatiseret krystalhøstbehandling og kryokooling og røntgendataindsamling ved flere synkrotroner i en enkelt og kontinuerlig arbejdsgang, der kan fjernstyres via en webbrowser. Disse rørledninger kan anvendes til at støtte hurtig bestemmelse af nye strukturer, karakterisering af protein-ligand komplekser og storstilet sammensatte og fragment screening gennem røntgenkrystallografi.
HTX-laboratoriet er udstyret med en ikke-volum krystalliseringsrobot (herunder et LCP-modul, der muliggør krystallisering af både opløselige og membranproteiner), krystalfarme (ved 5 °C og 20 °C), to robotvæskehåndteringsstationer til forberedelse af krystalliseringsskærme og to automatiserede CrystalDirect-krystalhøstere med kapacitet til at producere og opbevare op til 400 frosne prøvenåle pr. driftscyklus. Forskere sender deres prøver til anlægget med ekspreskurer, som derefter behandles af dedikerede teknikere på HTX-laboratoriet. Forskere kan fjerndesigne krystallisering screening og optimering eksperimenter gennem en web-interface, som CRIMS system. Gennem denne grænseflade kan de vælge mellem en lang række parametre og eksperimentelle protokoller, der er tilgængelige på anlægget, så de passer til deres specifikke prøvekrav. Resultater sammen med alle eksperimentelle parametre stilles til rådighed for brugerne i realtid gennem CRIMS. Alle modtagne prøver analyseres ved hjælp af en specielt udviklet metode , der gør det muligt at vurdere sandsynligheden for krystallisering af prøve25,26,27. Baseret på resultaterne af denne analyse fremsættes specifikke anbefalinger til brugerne vedrørende den optimale inkubationstemperatur og mulige forsøg med optimering af prøver. Når krystallisering eksperimenter er oprettet, videnskabsmand kan evaluere resultaterne ved at se på krystallisering billeder indsamlet på forskellige tidspunkter via internettet. Når krystaller, der er egnede til røntgen diffraktionsforsøg, identificeres, kan forskere bruge en dedikeret grænseflade til at etablere en krystalmonteringsplan, der derefter udføres af CrystalDirect-robotten.
CrystalDirect-teknologien er baseret på brugen af en modificeret dampdiffusoriseringsmikroplade og en laserstråle til at montere og kryokøle krystalprøver i diffraktionskompatible understøtter lukning af automatiseringskløften mellem krystallisering og dataindsamling15,16,17. Kort sagt dyrkes krystaller i en modificeret dampdiffusionsplade, CrystalDirect-mikropladen. Når krystaller vises CrystalDirect høst robot automatisk anvender en laserstråle til punktafgifter en film stykke, der indeholder krystal, vedhæfte den til en standard diffraktion dataindsamling pin, og kryo-cool det i en nitrogen gasstrøm (se Zander et al. 2016 og https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denne teknologi har en række yderligere fordele i forhold til manuelle eller halvautomatiske krystalmonteringsprotokoller. For eksempel er krystallernes størrelse og form ikke et problem, hvilket gør det lige så nemt at høste store krystaller eller mikrokrystaller, det er ofte muligt at undgå brugen af kryo-protectants på grund af den specielle måde, hvorpå teknologien fungerer (se reference 17, Zander et al.), hvilket gør X-ray diffraktionsanalyse meget mere ligetil. Laserstrålen kan også bruges som et kirurgisk værktøj til at vælge de bedste dele af en prøve, når krystaller vokser på klynger eller viser epitalsvækst for eksempel. CrystalDirect-teknologien kan også bruges til automatiserede iblødsætningsforsøg17. Levering af opløsninger med små molekyler eller andre kemikalier til krystaller. Derved gør det muligt at understøtte fuldautomatisk, storstilet forbindelses- og fragmentscreening. Når krystaller er høstet og cryocooled af CrystalDirect robot, de overføres til enten SPINE eller Unipuck pucks, som er kompatible med de fleste synkrone makromolekylær krystallografi strålelinjer rundt om i verden. Systemet kan høste op til 400 stifter (kapaciteten af den kryogene opbevaring Dewar) på en fuldt autonom måde. CRIMS kommunikerer med mejetærskeren robot under processen og giver automatiseret sporing af krystal prøver (pucks og stifter). Pucks er markeret med både stregkoder og RFID-tags for at lette prøvestyring21,28.
CRIMS giver en applikationsprogram interface (API), der understøtter automatiseret kommunikation med ISPyB-systemet, der understøtter administration og behandling af røntgendata på mange synkrotroner i Europa og verden29. Når automatiseret krystalhøst er afsluttet, kan forskerne vælge krystalprøver (pucks) og oprette prøveforsendelser til de makromolekylære krystallografibjælkelinjer på enten ESRF (Grenoble, Frankrig)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS overfører de data, der svarer til de valgte strålelinjeeksempler, til synkrotroninformationssystemet sammen med forudvalgte dataindsamlingsparametre. Når prøverne ankommer til den valgte synkrotronstrålelinje, udføres røntgendataindsamlingen enten manuelt, gennem fjernstråleoperation eller på en fuldautomatisk måde (dvs. ved MASSIF-1-strålelinjen i ESRF8, der drives af den fælles EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Efter dataindsamlingen henter CRIMS automatisk oplysninger om resultaterne af dataindsamling sammen med de første databehandlingsresultater, der udføres af synkrotrondatabehandlingssystemerne, og præsenterer dem for forskeren gennem en bekvem brugergrænseflade.
HTX-laboratoriet anvender disse automatiserede rørledninger til at understøtte tre forskellige applikationer, hurtige bestemmelseer af nye strukturer, hurtig karakterisering af protein-ligand komplekser og storstilet forbindelses- og fragmentscreening. Nedenfor beskriver vi, hvordan du bruger og betjener dem.
De automatiserede krystallografirørledninger, der er beskrevet her, er tilgængelige for forskere over hele verden gennem forskellige finansieringsprogrammer. I øjeblikket kan finansieret adgang til krystalliseringseksperimenter og CrystalDirect-teknologien opnås ved at anvende iNEXT Discovery-programmet og INSTRUCT-ERIC, mens adgang til makromolekylær krystallografistrålelinjer ved ESRF understøttes gennem ESRF-brugeradgangsprogrammet. Denne tilgang minimerer forsinkelsen mellem krystalvækst og måling, fremskynder udviklingen af meget udfordrende projekter, der kræver diffraktionsbaseret optimering af proteinproduktion og krystalliseringsforhold og frigør forskere fra komplekse operationer forbundet med krystallisering, krystalhåndtering og stråleoperation, hvilket gør krystallografi mere tilgængelig for ikke-ekspertgrupper. Det kan også bruges til hurtig udforskning af krystallisering tilsætningsstoffer, udfasning agenter eller til sammensatte screening gennem co-krystallisering eksperimenter. Mens de fleste krystallografiprojekter potentielt kunne drage fordel af denne tilgang, kan nogle prøver kræve særlige protokoller, der ikke kan modtages for automatisering eller til de rørledninger, der præsenteres her, for eksempel dem, der kræver mikrofluidiske systemer eller højt specialiserede krystalliseringsenheder eller prøver, der er ekstremt labile og ikke ville tolerere forsendelse.
CrystalDirect-teknologien muliggør også automatiseret krystalblødning17 til karakterisering af små molekyle-målkomplekser. Til dette oprettes en lille blænde med laseren forud for høstprocessen, og en dråbe af en opløsning, der indeholder de ønskede kemikalier (dvs. indfasningsmidler eller potentielle ligands) tilsættes ovenpå, så den kommer i kontakt med og diffunderer ind i krystalliseringsopløsningen, der til sidst når krystallen. Kemiske opløsninger kan formuleres i vand, DMSO eller andre organiske opløsningsmidler. Efter en vis inkubationstid kan krystallerne høstes og analyseres ved diffraktion som beskrevet ovenfor. Denne tilgang er blevet anvendt til hurtig karakterisering af ligandproteinkomplekser i forbindelse med strukturbaseret lægemiddeldesign samt på storstilet blandings- og fragmentscreening. I sidstnævnte tilfælde kan fragmentbiblioteker med hundreder til over tusind fragmenter hurtigt analyseres. Specifikke CRIMS-grænseflader, der ikke præsenteres her, letter design og automatiseret sporing af krystalblødningseksperimenter, mens integration mellem CRIMS-softwaren og Pipedream-softwarepakken, der er udviklet af Global Phasing Ltd (Storbritannien), muliggør automatiseret databehandling, indfasning, ligandidentifikation og strukturforbedring over hundredvis af datasæt parallelt, strømliner dataanalyse og fortolkning32,33 . For eksempel blev denne rørledning for nylig anvendt til identifikation af fragmenter, der binder både til det aktive sted og flere allosteriske steder i Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphat synthase, et centralt enzym af parasitten, der forårsager human afrikansk trypanosomiasis.
De rørledninger, der præsenteres her, kan bidrage til at fremskynde opdagelseshastigheden i strukturel biologi og gøre makromolekylær krystallografi mere tilgængelig for et større antal forskningsgrupper. Ved at lette omfattende screening af forbindelser og fragment kan de desuden bidrage til at fremme translationel forskning og fremskynde narkotikaopdagelsesprocessen og bidrage til at lette udviklingen af bedre og sikrere lægemidler mod et større antal mål.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke den fælles EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) for støtte til brug og drift af ESRF makromolekylære bjælkelinjer. Vi er taknemmelige for Matthew Bowler for støtte med dataindsamling på MASSIF-1 beamline af ESRF og Thomas Schneider og EMBL Hamburg Team for fremragende support med dataindsamling på P14 af PetraIII synkrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-mejetærseren er udviklet i samarbejde med Instrumentation Team hos EMBL Grenoble. Dette projekt blev støttet af midler fra Det Europæiske FællesskabsH2020-program under projekterne iNEXT (Grant No 653706) og iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes gennem Booster-programmet.
CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |