Et flowanalysesystem til perlebaserede multiplexed assays, som giver en to-reporter udlæsning blev brugt til udvikling af multiplex serologiske og antistofneutralisering assays, der samtidig kan måle neutraliserende IgG og IgM antistoffer for SARS-CoV-2.
COVID-19-pandemien har understreget behovet for hurtige metoder med høj kapacitet til følsom og specifik serologisk påvisning af infektion med nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testning kan være særlig nyttig, fordi den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, der optimerer patogendækningen og kontroller for variabilitet i organismen og den enkelte værtsrespons. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfære-baseret assay, der kan detektere både IgM og IgG antistoffer til tre store SARS-CoV-2 antigener-spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc). Analysen viste sig at have en sammenlignelig ydeevne med en SARS-CoV-2-referenceanalyse for IgG i serum, der blev fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde højere følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Ved hjælp af opløseligt ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat blev der påvist hæmning af antistofbinding for S og RBD.
COVID-19-pandemien har understreget vigtigheden af hurtigt at kunne udvikle og implementere hurtige, højtydende serologiske tests, der kan bruges til diagnosticering og overvågning af nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiske test kan være yderst nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mod flere antigener, hvilket giver mulighed for bred patogendækning og kontrol for variabilitet i organismen og værtsresponsen på infektion. Udviklingen af en multiplex fluorescerende perle-baseret assay, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), der kan opdage antistoffer mod spike (S) protein, spike angiotensin-konvertering enzym-2 (ACE2) receptor-bindende domæne (RBD), og nucleocapsid (Nc) af SARS-CoV-2 blev for nylig rapporteret1. 3Flex viste sig at have en reference-SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum, der var fremstillet i ≥21 dage fra symptomdebut, men havde større følsomhed med prøver indsamlet i ≤5 dage fra symptomdebut. Derudover blev hæmning af antistofbinding påvist for S- og RBD-antigener ved hjælp af opløselige ACE2 i et neutraliseringsanalyseformat. Multiplex perle-baseret teknologi er blevet bredt vedtaget som en gennemprøvet teknologi til multiplex serologisk test og har klare fordele for storstilet screening, herunder korte tid-til-resultater, små prøve krav, og reduceret arbejdskraft2,3,4.
For nylig er et nyt flowanalyseinstrument blevet tilgængeligt, der giver systemets samme højplex, high-throughput-kapacitet, der blev demonstreret i tidligere arbejde1, men med den ekstra fordel af to reporterkanaler. Evnen til at måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaktion gør det muligt at vurdere to resultater pr. analysand for hver prøve og er ideel til isotypingapplikationer, som typisk skal udføres i separate reaktions brønde5. Den dobbelte reporter kapacitet giver dobbelt så mange data for hver prøve i halvt så mange reaktion brønde med halvdelen af prøven volumen krav, og dermed har en klar fordel i forhold til enkelt reporter systemer. Denne undersøgelse beskriver standard serologisk assay protokol og beskriver tilpasningen til en neutralisering assay. Derudover beskriver denne rapport konverteringen af enkelt reporter assay til en dobbelt reporter serologisk analyse, og efterfølgende, en dobbelt reporter neutralisering assay, til samtidig at måle neutraliserende antistoffer af både IgG og IgM isotyper mod SARS-CoV-2 S, RBD, og Nc antigener. Der findes en visuel oversigt over analyseprotokollen i figur 1.
Denne undersøgelse udvidede funktionaliteten af en multiplex fluorescerende mikrosfære assay, 3Flex, der kvalitativt vurderer IgG reaktion på infektion ved SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 registrerer et enkelt antigen, evaluerer denne analyse samtidig S, RBD og Nc antigener og omfatter en intern antistofisotypekontrol7. Derudover bruges ACE2 som en indikator til at opdage neutraliserende antistoftiter til SARS-CoV-2.
Multiantigenanalyser kan være særligt nyttige i fremtiden til diskriminerende immunrespons mellem inficerede og vaccinerede personer. Med SARS-CoV-2, hvis kun S- og RBD-antistoffer vurderes, ville det være umuligt at afgøre, om dette skyldtes en tidligere infektion eller et vaccinationsantistofrespons. Ingen af de vacciner, der i øjeblikket anvendes, er rettet mod Nc-antigen, så ved at evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det muligt at skelne tidligere virusinfektion (Nc- og S/RBD-positiv) fra et vaccinationsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).
I den aktuelle undersøgelse blev 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser (afsnit 5 og 6) overført til et nyt dobbelt reporterflowanalyseinstrument (afsnit 7 og 8). Typiske immunoassay protokoller for perle-baserede multiplex assays ligner standard ELISA protokoller, efter sammenlignelige trin for prøve inkubation, detektion antistof / reporter inkubation, og analyse af resultater8. Tidligere undersøgelser har også vist, hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebaseret multiplexingplatform9.
Analysen protokoller kunne problemfrit overføres fra forgængeren enkelt reporter instrument til den nye dobbelt reporter system, som det fremgår af de resultater, der er opnået for testprøver og kontrol (figur 4 og figur 5). I den serologiske analyse påviste alle positive serumprøver et karakteristisk dosisfølsomt fald i signal svarende til både en højere prøvefortynding og en lavere detektionsantistofkoncentration, mens signalerne til de negative prøver forblev på baggrundsniveau. Tilsvarende svarede faldende signaler for S og RBD, men ikke Nc, til stigende koncentrationer af ACE2-konkurrenten, mens IgG strippet serum var langt mindre påvirket af tilsætning af ACE2. Præinkubation af perlerne med ACE2 i 2 min før tilsætning af serumprøven (som beskrevet i afsnit 6 og 8) blev også sammenlignet med at kombinere perlerne med ACE2 og serum på samme tid og gav kun ringe forskel i resultaterne (data, der ikke blev vist). Men da de opnåede resultater med perlerne plus ACE2 pre-inkubation skridt var mere konsekvent, det var den endelige procedure vedtaget for neutralisering assay protokol (afsnit 6 og 8).
Fordi den dobbelte reporter system indeholder en anden fluorescerende reporter kanal, begge assays blev omdannet til isotyping assays til samtidig at måle både IgG og IgM svar. Den dobbelte reporter funktionalitet flow analysator tillader indsamling af fluorescerende signaler fra to reporter detektion reagenser for hver analysand i multiplex for hver prøve, effektivt fordoble de data, der genereres pr prøve i en analyse. Til udvikling og optimering af de dobbelte reporter assay protokoller, flere kommercielt tilgængelige reporter farvestoffer og detektion antistoffer blev evalueret for den nye RP2 kanal (Figur 7 og Figur 8) for at bestemme den bedste løsning (r) til rådighed. Anti-IgM-antistoffet, der blev konjugeret med DL 405-reporterfarven, klarede sig ikke godt i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB blev efterfølgende evalueret til påvisning i RP2-kanalen (Figur 8). Tre kombinationer af RP1- og RP2-detektionsreagenser blev sammenlignet i den dobbelte reporterneutraliseringsanalyse (tabel 1 og figur 9) for at bestemme de kombinationer, der klarer sig bedst, til samtidig påvisning af IgG- og IgM-neutraliserende antistoffer. Mens der var betydelige forskelle i signalintensiteten mellem RP1-kanalen ved hjælp af PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjælp af DL 549 anti-IgM, var der ingen signifikant forskel i målingen af den procent bindende hæmning af ACE2.
Flere begrænsninger i den nuværende metode, og denne undersøgelse er anerkendt. For det første var prøverne testet og anvendt i metodens udvikling og optimering begrænset til sæt af 8-11 prøver. Flere prøver vil blive testet i udvidede undersøgelser for at kontrollere, at metoden er fuldt optimeret. For det andet blev et begrænset antal reporter fluorophores og reporter par testet. Yderligere test af alle tilgængelige journalister i alle mulige kombinationer vil afgøre, hvilke reagenser der kan bruges med succes i denne metode. Anti-IgG antistof konjugeret til biotin var anderledes end anti-IgG antistof konjugeret til BV 421 reporter. Så selv om variabilitet i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterede, kunne det skyldes specificiteten af antistoffet og ikke relateret til reporterfarven. Test af andre tilgængelige BV 421-konjugerede antistoffer kan identificere et andet antistof, der ville klare sig godt i RP2-kanalen. Fremtidige undersøgelser vil også evaluere kombinationen af PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG til påvisning i henholdsvis RP1 og RP2. Sidst, selv med den dobbelte reporter kapacitet af instrumentet, assays er begrænset til to isotyper (to parametre) pr reaktion. Hvis yderligere isotyper skal måles eller fuld isotyping ønskes, skal yderligere reaktioner ved hjælp af de samme to reporterkanaler køres i separate brønde.
Perlebaseret multiplexingteknologi giver mulighed for hurtigt og fleksibelt analysedesign med nem implementering i rutinemæssige laboratoriearbejdsgange3,4,10. Denne undersøgelse viste, at det er nemt at overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og neutraliseringsanalyser til SARS-CoV-2 til et flowanalysesystem til måling af IgG med en enkelt reporter eller med mindre modifikation, der samtidig måler både IgG- og IgM-respons ved hjælp af to journalister. Den dobbelte reporter mulighed har klare fordele i forhold til enkelt reporter platforme, fordi det kan give dobbelt så mange data pr prøve, ved hjælp af halvdelen af prøven volumen, og i halvdelen af antallet af reaktion brønde. Med de relevante reporter farvestoffer og detektion antistoffer, isotyping assays kan nemt udvikles og udføres på den dobbelte reporter flow analyse instrument.
The authors have nothing to disclose.
Denne rapport blev finansieret af Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for videnskabelig redigering bistand.
ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |