Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

A retina vertebrada é talvez a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), e serve como um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro. Cinco classes de neurônios na retina são distribuídos em três camadas nucleares separadas por duas camadas plexiformes. A camada nuclear externa (ONL) consiste em fotorreceptores clássicos (hastes e cones) que convertem luz em sinais elétricos. Os sinais elétricos são processados por neurônios na camada nuclear interna (INL), incluindo células bipolares, horizontais e amacrinas, e depois transmitidos para células gânglios da retina (RGCs) na camada celular de gânglio (GCL). Os RGCs são os neurônios de saída da retina, com os axônios projetando para o cérebro contribuir para a formação de imagens e função visual não-formadora de imagens. Além disso, três tipos de células gliais (células Muller, astroglia e microglia) fornecem nutrientes aos neurônios e protegem os neurônios de alterações nocivas em seu ambiente extracelular.

Uma subpopulação especializada de células amacrinas produz e libera dopamina, um importante neuromodulador no CNS, reconfigurando circuitos neurais da retina durante a adaptação da luz^1,2. As células amacrinas dopaminérgicas (DACs) têm uma característica única de perfis morfológicos. Sua somata está localizada no INL proximal com dendritos ramificantes na parte mais distal da camada plexiforme interna (IPL). Os processos semelhantes ao Axon de DACs são nãoomiados, finos e longos, pouco ramificados e têm varizes (os locais de liberação de dopamina). Eles formam um plexo denso com dendritos no IPL, incluindo estruturas semelhantes a anel ao redor da somata de células amacrinas AII. Os axônios também atravessam o INL em direção ao OPL, formando uma via centrífuga através da retina³. Demonstramos que o DAC processa receptores expressos em resposta à liberação de glutamato de neurônios pré-sinápticos, incluindo células bipolares e células de gânglios intrinsecamente fotosensíveis da retina (ipRGCs)^4,5,6. No entanto, não está claro se os receptores de glutamato expressam nos axônios, dendritos ou ambos, uma vez que são cortados em seções verticais de retina e não podem ser distinguidos uns dos outros^5,6. A imunostaining precisa ser realizada em retinas de montagem inteira para revelar ramificações tridimensionais de DACs e a presença de receptores de glutamato em compartimentos subcelulares. Embora a retina seja relativamente transparente, a espessura de uma retina de montagem inteira de um rato é de aproximadamente 200 μm, o que limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução devido à dispersão da luz tecidual. Para superar essas limitações, adaptamos o método de delipidação de hidrogel de tecido compatível com imunosstaining (CLARITY) desenvolvido recentemente para seções cerebrais grossas para retinas de camundongos de montagem inteira⁷.

O método CLARITY foi originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas⁷. Ele usa um detergente forte, sulfato de dodecila de sódio (SDS) e eletroforese para remover os componentes lipídicos (que causam dispersão de luz tecidual), deixando as proteínas e ácidos nucleicos no lugar. Os lipídios removidos são substituídos por um andaime transparente composto por monômeros de hidrogel, como acrilamida, para suportar a estrutura proteica restante. O tecido limpo pode ser rotulado através de imunohistoquímica e imageado com profundidade de penetração de luz substancialmente aumentada através do tecido (até vários milímetros abaixo da superfície do tecido). Desde então, o método CLARITY tem sido otimizado e simplificado por diversos grupos de pesquisa^8,9,10. Um protocolo clarity modificado usa uma técnica de compensação passiva para evitar os possíveis danos teciduais produzidos pela eletroforese para limpar todo o cérebro e outros órgãos intactos¹¹. No entanto, este método ainda não foi aplicado a retinas de montagem inteira. Aqui, adaptamos a técnica de CLARIDADE passiva para retinas de montagem integral para torná-las mais transparentes para a imunohistoquímica e a imagem. Descobrimos que a maioria das proteínas da retina testadas foram preservadas durante esse processo para imunohistoquímica. Usando a solução de correspondência de índices refrativos, fomos capazes de imaginar neurônios de retina através da espessura de aproximadamente 200 μm do ONL para o GCL em retinas de montagem inteira.