Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

Het gewervelde netvlies is misschien wel het meest toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de ontwikkeling, structuur en functie van de hersenen. Vijf klassen neuronen in het netvlies zijn verdeeld in drie nucleaire lagen gescheiden door twee plexivormlagen. De buitenste kernlaag (ONL) bestaat uit klassieke fotoreceptoren (staven en kegels) die licht omzetten in elektrische signalen. Elektrische signalen worden verwerkt door neuronen in de binnenste nucleaire laag (INL), waaronder bipolaire, horizontale en amacrinecellen, en vervolgens overgebracht naar retinale ganglioncellen (RGCs) in de ganglioncellaag (GCL). RGC’s zijn de outputneuronen van het netvlies, waarbij de axonen naar de hersenen projecteren om bij te dragen aan beeldvormende en niet-beeldvormende visuele functie. Bovendien leveren drie soorten gliacellen (Muller-cellen, astroglia en microglia) voedingsstoffen aan neuronen en beschermen neuronen tegen schadelijke veranderingen in hun extracellulaire omgeving.

Een gespecialiseerde subpopulatie van amacrinecellen produceert en geeft dopamine vrij, een belangrijke neuromodulator in het CZS, die retinale neurale circuits herconfigureert tijdens lichtaanpassing^1,2. Dopaminerge amacrinecellen (DAC’s) hebben een uniek kenmerk van morfologische profielen. Hun somata bevinden zich in de proximale INL met dendrieten die rammen in het meest distale deel van de binnenste plexivormlaag (IPL). Axon-achtige processen van DAC’s zijn ongemyelineerd, dun en lang, schaars vertakt en dragen spataderen (de plaatsen van dopamine-afgifte). Ze vormen een dichte plexus met dendrieten in de IPL, inclusief ringachtige structuren rond de somata van AII amacrinecellen. De axonen lopen ook door de INL naar de OPL en vormen een centrifugale route over het netvlies³. We hebben aangetoond dat DAC-processen receptoren uitdrukken als reactie op glutamaatafgifte uit presynaptische neuronen, waaronder bipolaire cellen en intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGCs)^4,5,6. Het is echter onduidelijk of glutamaatreceptoren zich uitdrukken op de axonen, dendrieten of beide, omdat ze zijn afgesneden in verticale retinale secties en niet van elkaar kunnen worden onderscheiden^5,6. Immunostaining moet worden uitgevoerd in volledig gemonteerde netvliezen om driedimensionale vertakking van DAC’s en de aanwezigheid van glutamaatreceptoren op subcellulaire compartimenten aan het licht te komen. Hoewel het netvlies relatief transparant is, is de dikte van een muis volledig gemonteerd netvlies ongeveer 200 μm, wat de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel beperkt en de lichtpenetratie vermindert voor beeldvorming met hoge resolutie als gevolg van weefsellichtverstrooiing. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de immunostaining compatibele weefselhydrogel delipidatiemethode (CLARITY) die onlangs is ontwikkeld voor dikke hersensecties, aangepast aan het netvlies van de muis⁷.

De CLARITY-methode is oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters⁷. Het maakt gebruik van een sterk reinigingsmiddel, natriumdodecylsulfaat (SDS) en elektroforese om de lipidecomponenten te verwijderen (die weefsellichtverstrooiing veroorzaken), waardoor de eiwitten en nucleïnezuren op hun plaats blijven. De verwijderde lipiden worden vervangen door een transparante steiger bestaande uit hydrogelmonomeren zoals acrylamide ter ondersteuning van de resterende eiwitstructuur. Het gewiste weefsel kan worden geëtiketteerd via immunohistochie en afgebeeld met aanzienlijk verhoogde lichtpenetratiediepte door het weefsel (tot enkele millimeters onder het weefseloppervlak). Sindsdien is de CLARITY-methode geoptimaliseerd en vereenvoudigd door verschillende onderzoeksgroepen^8,9,10. Een gewijzigd CLARITY-protocol maakt gebruik van een passieve clearingtechniek om de mogelijke weefselschade veroorzaakt door elektroforese te voorkomen voor het opruimen van de hele hersenen en andere intacte organen¹¹. Deze methode is echter nog niet toegepast op retina’s met hele montering. Hier hebben we de passieve CLARITY-techniek voor volledig gemonteerde retina’s aangepast om ze transparanter te maken voor immunohistochie en beeldvorming. We ontdekten dat een meerderheid van de geteste retinale eiwitten tijdens dit proces werd bewaard voor immunohistochgie. Met behulp van de refractieve index matching oplossing, waren we in staat om retinale neuronen in beeld te brengen over de ongeveer 200 μm dikte van de ONL naar de GCL in hele retinas.