Hier presenteren we een protocol om de CLARITY-methode van de hersenweefsels aan te passen voor volledig gemonteerde retinas om de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en hoge resolutie beeldvorming van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren te verbeteren.
De weefselhydrogeldelipidatiemethode (CLARITY), oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium, is gewijzigd en wordt veel gebruikt voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters. Deze geavanceerde technologie is echter nog niet gebruikt voor volledig gemonteerde retina’s. Hoewel het netvlies gedeeltelijk transparant is, beperkt de dikte van ongeveer 200 μm (bij muizen) nog steeds de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel en vermindert het de lichtpenetratie voor beeldvorming met hoge resolutie. Hier hebben we de CLARITY-methode voor het netvlies van de muis in zijn geheel aangepast door ze te polymeriseren met een acrylamidemonomeer om een nanoporeuze hydrogel te vormen en ze vervolgens te verwijderen in natriumdodecylsulfaat om eiwitverlies te minimaliseren en weefselschade te voorkomen. CLARITY-verwerkte retinas werden immunostained met antilichamen voor retinale neuronen, gliacellen en synaptische eiwitten, gemonteerd in een refractieve index matching oplossing, en afgebeeld. Onze gegevens tonen aan dat CLARITY de kwaliteit van standaard immunohistochemische kleuring en beeldvorming voor retinale neuronen en gliacellen in de hele montering kan verbeteren. Bijvoorbeeld, 3D-resolutie van fijne axon-achtige en dendritische structuren van dopaminerge amacrine cellen werden veel verbeterd door CLARITY. In vergelijking met niet-verwerkte retina’s met hele monturen kan CLARITY immunostaining onthullen voor synaptische eiwitten zoals postsynaptisch dichtheidseiwit 95. Onze resultaten tonen aan dat CLARITY het netvlies optisch transparanter maakt na het verwijderen van lipiden en fijne structuren van retinale neuronen en hun eiwitten behoudt, die routinematig kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van beeldvorming met hoge resolutie van retinale neuronen en hun subcellulaire structuren in de voorbereiding van de hele berg.
Het gewervelde netvlies is misschien wel het meest toegankelijke deel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de ontwikkeling, structuur en functie van de hersenen. Vijf klassen neuronen in het netvlies zijn verdeeld in drie nucleaire lagen gescheiden door twee plexivormlagen. De buitenste kernlaag (ONL) bestaat uit klassieke fotoreceptoren (staven en kegels) die licht omzetten in elektrische signalen. Elektrische signalen worden verwerkt door neuronen in de binnenste nucleaire laag (INL), waaronder bipolaire, horizontale en amacrinecellen, en vervolgens overgebracht naar retinale ganglioncellen (RGCs) in de ganglioncellaag (GCL). RGC’s zijn de outputneuronen van het netvlies, waarbij de axonen naar de hersenen projecteren om bij te dragen aan beeldvormende en niet-beeldvormende visuele functie. Bovendien leveren drie soorten gliacellen (Muller-cellen, astroglia en microglia) voedingsstoffen aan neuronen en beschermen neuronen tegen schadelijke veranderingen in hun extracellulaire omgeving.
Een gespecialiseerde subpopulatie van amacrinecellen produceert en geeft dopamine vrij, een belangrijke neuromodulator in het CZS, die retinale neurale circuits herconfigureert tijdens lichtaanpassing1,2. Dopaminerge amacrinecellen (DAC’s) hebben een uniek kenmerk van morfologische profielen. Hun somata bevinden zich in de proximale INL met dendrieten die rammen in het meest distale deel van de binnenste plexivormlaag (IPL). Axon-achtige processen van DAC’s zijn ongemyelineerd, dun en lang, schaars vertakt en dragen spataderen (de plaatsen van dopamine-afgifte). Ze vormen een dichte plexus met dendrieten in de IPL, inclusief ringachtige structuren rond de somata van AII amacrinecellen. De axonen lopen ook door de INL naar de OPL en vormen een centrifugale route over het netvlies3. We hebben aangetoond dat DAC-processen receptoren uitdrukken als reactie op glutamaatafgifte uit presynaptische neuronen, waaronder bipolaire cellen en intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGCs)4,5,6. Het is echter onduidelijk of glutamaatreceptoren zich uitdrukken op de axonen, dendrieten of beide, omdat ze zijn afgesneden in verticale retinale secties en niet van elkaar kunnen worden onderscheiden5,6. Immunostaining moet worden uitgevoerd in volledig gemonteerde netvliezen om driedimensionale vertakking van DAC’s en de aanwezigheid van glutamaatreceptoren op subcellulaire compartimenten aan het licht te komen. Hoewel het netvlies relatief transparant is, is de dikte van een muis volledig gemonteerd netvlies ongeveer 200 μm, wat de penetratie van antilichamen in het diepe weefsel beperkt en de lichtpenetratie vermindert voor beeldvorming met hoge resolutie als gevolg van weefsellichtverstrooiing. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we de immunostaining compatibele weefselhydrogel delipidatiemethode (CLARITY) die onlangs is ontwikkeld voor dikke hersensecties, aangepast aan het netvlies van de muis7.
De CLARITY-methode is oorspronkelijk ontwikkeld door het Deisseroth-laboratorium voor immunostaining en beeldvorming van dikke hersenmonsters7. Het maakt gebruik van een sterk reinigingsmiddel, natriumdodecylsulfaat (SDS) en elektroforese om de lipidecomponenten te verwijderen (die weefsellichtverstrooiing veroorzaken), waardoor de eiwitten en nucleïnezuren op hun plaats blijven. De verwijderde lipiden worden vervangen door een transparante steiger bestaande uit hydrogelmonomeren zoals acrylamide ter ondersteuning van de resterende eiwitstructuur. Het gewiste weefsel kan worden geëtiketteerd via immunohistochie en afgebeeld met aanzienlijk verhoogde lichtpenetratiediepte door het weefsel (tot enkele millimeters onder het weefseloppervlak). Sindsdien is de CLARITY-methode geoptimaliseerd en vereenvoudigd door verschillende onderzoeksgroepen8,9,10. Een gewijzigd CLARITY-protocol maakt gebruik van een passieve clearingtechniek om de mogelijke weefselschade veroorzaakt door elektroforese te voorkomen voor het opruimen van de hele hersenen en andere intacte organen11. Deze methode is echter nog niet toegepast op retina’s met hele montering. Hier hebben we de passieve CLARITY-techniek voor volledig gemonteerde retina’s aangepast om ze transparanter te maken voor immunohistochie en beeldvorming. We ontdekten dat een meerderheid van de geteste retinale eiwitten tijdens dit proces werd bewaard voor immunohistochgie. Met behulp van de refractieve index matching oplossing, waren we in staat om retinale neuronen in beeld te brengen over de ongeveer 200 μm dikte van de ONL naar de GCL in hele retinas.
Wijziging van het CLARITY-protocol voor retina’s met hele montering.
We hebben het CLARITY-protocol vereenvoudigd om adequate polymerisatie te bereiken zonder dat er een vacuümevacuatie- of uitdrogingskamer nodig is, zoals wordt gebruikt in de meeste eerdere studies7,9,11. Het polymerisatieproces wordt geremd door zuurstof, waardoor het monster tijdens de polymerisatiestap van het protocol uit de lucht moet …
The authors have nothing to disclose.
We willen Bing Ye, Nathan Spix en Hao Liu bedanken voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) en Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |