Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştir. 1. Crypt izolasyonu ve kültürü için reaktiflerin hazırlanması (doku kültürü davlumbazında hazırlanın) 50 mM etilenediamin tetraasetik asit (EDTA): 500 mL hazırlamak için kalsiyum (Ca 2+ ) ve magnezyum (Mg2+) olmadan 450 mL fosfat tamponlu saline 50 mL 0.5 M stok ekleyin. Bu protokolde PBS, aksi belirtilmedikçe kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS’ye atıfta bulunacaktır. Sallama tamponu: 500 mL hazırlamak için PBS’de 7,4 g sakkaroz (43,3 mM) ve 5 g sorbitol (54,9 mM) çözün. L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin ve Noggin) medya: Supplement Advanced Dulbecco’s Modifiye Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 mL) ile Fetal Sığır Serumu (FBS) (200 mL), 1x piyasada bulunan glutamin takviyesi (10 mL), 100 U/mL penisilin ve, 100 g/mL streptomisiyan (10 mL) ve filtre 0,22 μm filtre ile sterilize edilir. L-WRN hücrelerini ATCC’den geçirin, T175 şişelerinde büyüyün ve Geneticin ve Hygromycin’i kullanmayı seçin. Medya değiştirilir ve 12 gün boyunca toplanır.NOT: Her ortam grubu, TOPflash Wnt Reporter tahlili kullanılarak Wnt etkinliği için sınanmıştır. Bu durumda Michigan Tıp Çevirisel Doku Modelleme Laboratuvarı protokolleri (https://www.umichttml.org/protocols) takip edilmiştir. TOPflash HEK 293 hücre hattı, bir T75 şişesinde izdiah olarak yetiştirilir, denenmez ve 96 kuyulu bir plakaya kaplanır. Ertesi gün toplanan ortamın farklı seyreltmeleri hücrelere eklenir ve bir gecede 37 ° C’de% 5 CO2 inkübatörde inkübe edilir. Ertesi gün, hücreler lislenir ve Firefly Luciferase tahlili üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir. Test, rekombinant Wnt-3A kullanılarak normalleştirilir. Ortam, 50 mL konik tüplerde 25 mL aliquots’a ayrılır ve -80 °C’de saklanır. Baz medya: 500 mL için, 2x ticari olarak mevcut glutamin takviyesi (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penisilin ve, 100 g/mL streptomisiyan (10 mL), 2 mM N-asetil-L-sistein (2 mL), N2 takviyesi (10 mL) ve B27 takviyesi (20 mL), 0,22 μm filtre ile sterilize edin. Medyayı 50 mL konik tüpte 25 mL aliquots’a bölün ve -80 °C’de saklayın. LWRN komple ortam: 25 mL LWRN medyayı 25 mL baz ortamla birleştirin ve 200 ng/mL Epidermal büyüme faktörü (EGF) (20μL) ve 2x antibiyotik-antimykotik çözelti (1 mL) ile destekleyin. Tüm ortamı 4 °C’de saklayın. Kollajen ve Laminin: 1 mg/mL stok konsantrasyonu üretmek için 5 mg tozu 5 mL filtre sterilize edilmiş 100 mM asetik asitte çözün (9,94 mL moleküler dereceli suya 60 μL asetik asit stoğu ekleyin). 4 saat boyunca 4 °C’de döndürün ve 0,2 mL tüplerde 100 μL aliquot yapın. -20 °C’de dondurun. Laminin 100 μg/ mL stok konsantrasyonu ile satın alınır. Büyüme faktörleri olmadan komple ortam (CMGF-): 1x ticari olarak mevcut glutamin takviyesi (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penisilin ve 100 g/mL streptomisin (5 mL) ile Gelişmiş DMEM/F12 (500 mL) takviyesi. Farklılaşma ortamı: 9,2 mL CMGF-ortam, 200 μL B27 takviyesi, 100 μL N2 takviyesi, 20 μL N-asetil-L-sistein, 500 μL Noggin media12 (Noggin üreten hücrelerden yapılmış) ve 2 μL EGF ekleyerek 10 mL farklılaşma ortamı yapın. 2. Plakaların, hazneli slaytların ve hücre kültürü membran uçlarının hazırlanması Kaplama için 48 kuyu plakası ve hazneli kaydıraklar 2D monolayer: Soğuk Dulbecco’nun Fosfat tamponlu salininde laminin (1:40 seyreltme, bkz. Malzeme Tablosu)ve kollajen (1:30 seyreltme) oluşturan kaplama çözeltisini Ca2+ ve Mg2+ (DPBS) ile kullanın. Her kuyuya 200 μL kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı / hazne slaydını en az2 saat boyunca 37 °C’de% 5 CO 2 inkübatörde önceden kuluçkaya yatırın. Kaplama 0.4 μm hücre kültürü membran ekler: Moleküler sınıf suda kollajenin 1:30 seyreltilmesini yapın ve her kesici uç içine 200 μL ekleyin. Membran kesici ucu içeren plakayı 30 dakika boyunca 4 °C’de buz üzerinde tutun. 30 dk inkübasyonu takiben, plakayı 1,5-2 saat boyunca37 °C’de% 5 CO 2 inkübatörde tutun. Polyester ve polikarbonat membran kesici uçlar benzer sonuçlar verir.NOT: Kaplama yüzeyinin tam kapsamını elde etmek için kollajen/laminin hacmini ayarlayarak bu protokol kullanılarak herhangi bir doku kültürü plakası tohumlanabilir (yukarı ve aşağı ölçekleme yapılabilir). 3. Crypt izolasyonu NOT: Diseksiyona başlamadan önce kollajen ve/veya laminin kaplı plaka/membran uçları/hazneli slayt hazırlayın ve 37 °C’de%5 CO 2 inkübatörde bırakın. Ameliyat için uygun temiz bir çalışma tezgahı ve steril cerrahi aletler ve 2D monolayerleri kültleme için biyolojik bir güvenlik kabini hazırlayın. Nemlendirilmiş CO 2 inkübatörü, masa üstü santrifüjler (4 °C’de tutulur), mikroskop ve pipetler (serolojik pipetler dahil) gibi2D monolayer kültürleme için diğer tüm standart ekipmanları onaylayın. 8-12 haftalık C57Bl / 6 fareler kullanın. Onaylanan bir ötenazi yöntemi kullanarak fareleri ötenazi. Diseksiyon alanını temizlemek ve kağıt mendil kullanarak fazla EtOH’yi çıkarmak için fare karkaslarını% 70 etanol (EtOH) çözeltisi ile püskürtün.NOT: Crypt isolation reaktiflerinin (PBS, 50 mM EDTA, shake buffer gibi) mahzenlerinin soğuk tutulmasını sağlayın. Bu reaktifler bir gün önce hazırlanabilir ve 4 °C’de depolandığında en az 3 ay boyunca kullanıma hazırdır. Ayrıca, LWRN komple ortamın kullanıma kadar 37 °C’de tutulan bir boncuk/su banyosunda tutulduğundan emin olun. Temiz diseksiyon makası ve tokmaklar kullanarak, kolonu rektumdan cecum’a kadar parçalara ayırın. Kolonun ucunu tokalar kullanarak tutun ve 20 G besleme tüpü ile donatılmış 10 mL şırıng içinde buz gibi PBS kullanarak dışkıyı hafifçeyıkayın (Şekil 1A). Kolonu yırtmamaya dikkat edin. Proksimal iki nokta üst üsteyi çıkarın. Bu, kolonun ileocecal birleşime en yakın kısmı olacaktır. Tokalarla, distal kolonu 20 G besleme tüpüne hafifçe kaydırın, tüpün ucundaki kolonu 4-0 ipek dikiş ipliği ile uçtan tutun (Şekil 1B). Birinin parmaklarını ucundan bağlayarak iki nokta üst üste ters çevirin ve diğer ucunu 4-0 ipek dikiş ipliği ile bağlayın. Cerrahi makas kullanarak, besleme tüpünün ucunun altındaki kolonu kesin (Şekil 1C,D,E). 1,25 mL’lik bir tekrar şırınnasının pistonunu kullanarak, ters kolonun çözünmemiş ucunu 1,25 mL’lik bir tekrar şırınnanın ucuna hafifçe açın. Ters kolonu şırındının ucuna kaydırın ve 4-0 ipek dikiş ipliği ile sıkıca bağlayın(Şekil 1F,G). Pistonu şırındağa yerleştirin ve bir sosis oluşturmak için kolonu şişirin. Kolon sosisi görünür kırışıklıklar olmadan turgent görünene kadar şişirin (Şekil 1H). Şırınd/kolonu 20 dakika boyunca buz üzerine 5 mL Hücre Kurtarma Çözeltisi ile 15 mL tüpe yerleştirin, kolonu her 5 dakikada bir şişirin vesöndürün (Şekil 1I). Sosis kuluçka sırasında şişirilmiş kalmalıdır. Kolon şişirilmiş olarak tekrar şırındağının ucunun altında 4-0 ipek dikiş ipliği kullanarak bağlayın. Sosisi tekrar şırınnadan kesin ve 40 dakika boyunca 10 mL 50 mM (ince bağırsak için 2mM) EDTA içeren 15 mL tüpe yerleştirin ve 4 °C’dedöndürün (Şekil 1J,K). EDTA çözeltisini dekantlayın ve 5 mL sallama tamponu ile değiştirin. Sosisi 2 dakika boyunca dikey pozisyonda (kuvvetlice) manuel olarak çalkalayın. Sallama çözeltisini yeni bir 15 mL tüpe deklare edin ve sallama tamponunda toplam 10 mL crypt için sallama adımını tekrarlayın. Bir Petri kabına 20 μL crypt süspansiyonu alın ve mikroskop altında mahzen sayısını sayın. Mahzenlerdeki/μL’deki mahzen konsantrasyonunun hesaplayın. Konsantrasyona bağlı olarak, kaplama anında 5 mahzen / μL elde etmek için numuneleri seyreltin (1000 mahzen /cm2). Tüpü, 4 °C’de 10 dakika boyunca 400 x g’da masa üstü santrifüj kullanarak izole edilmiş mahzenlerle döndürün. Bu arada, 48 kuyu plakası/ kesici uç / oda kaydırağından çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. P200 kullanarak kaplama soluyun ve hücreler kaplanmaya hazır olana kadar plakayı kapakla hafifçe dengede bırakın. 4. Kült 2D monolayer NOT: 3D kolonoidlerden bağırsak epitel monolayerlerinin nasıl üretilme konusunda ayrıntılı bir protokol için Estes ve Kovbasnjuk laboratuvarlarının protokollerini kontrol edin (7,11). 10 mL serolojik pipet kullanarak sallama tamponu çıkarın. Peletin sağlam olduğundan ve kalan sıvıları çıkarmak için P1000’i kullanabileceğinden emin olun. Peletin 3 mL LWRN komple ortam ve pipet yukarı ve aşağı P1000 ile yeniden askıya alın. Önceden kaplanmış 48 kuyulu plaka/hazne kaydırağın her kuyusuna 200 μL crypt ekleyin ve 37 °C’de %5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün P200 kullanarak medyayı aspire edin ve yeni ortam ekleyin. Hücreler 24-48 saat içinde birleşir. Hücre kültürü membran uçları için, kesici uçların üstüne 200 μL mahzen (5 crypts/μL) ve alt kısma 600 μL komple L-WRN ortamı ekleyin. Ertesi gün P200 kullanarak medyayı aspire edin ve yalnızca üst bölmeye taze ortam ekleyin. Plakayı 37 °C’de%5 CO 2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Transepithelial Elektrik Direnci (TEER) her gün Epitel Volt/Ohm metre (EVOM) kullanılarak ölçülür.NOT: Kültürün 300 Ω.cm2’denbüyük bir TEER okuması varsa, bunların bir araya geldiği amaçlanır. 3-4 gün içinde izdiah elde edilir. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.