הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

למרות העובדה כי חבילות סטריאוסיליה בתאי השיער השמיעתיים גדולות מספיק כדי להיות דמיינו על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולהסיט בתאים חיים בניסוי מהדק תיקון, המרכיבים המבניים החיוניים של מכונות transduction כגון קישורי קצה ניתן לדמיין רק עם מיקרוסקופיית אלקטרונים בתאים מתים. בתאי השיער השמיעתי של היונקים, מכונות התמרה ממוקמות בקצוות התחתונים של קישורי הקצה, כלומר, בקצות סטריאציליה שורה קצרה^{יותר 1} ומוסדרת באופן מקומי באמצעות האיתות בקצות סטרירוצ’ליה^2,3. עם זאת, הדמיה ללא תוויות של מבני פני השטח במיקום זה בתאי שיער חיים אינה אפשרית בשל הגדלים הקטנים של סטריאוטיפיליה.

ללולאה היונקים יש שני סוגים של תאים חושיים שמיעתיים: תאי שיער פנימיים וחיצניים. בתאי השיער הפנימיים, סטריוציליה ארוכה ועבה יותר בהשוואה לאלו בתאי השיער החיצוניים⁴. השורה הראשונה והשנייה של סטריאוטיפיליה יש קוטר של 300-500 ננומטר בתאי שיער פנימיים עכבר או חולדה. בשל עקיפה של אור, הרזולוציה המרבית בר השגה עם מיקרוסקופיה אופטית ללא תווית היא כ 200 ננומטר. לפיכך, הדמיה של סטריאוטיפיליה בודדת בתוך השורות הראשונה והשנייה של חבילת תא השיער הפנימית קלה יחסית עם מיקרוסקופיה אופטית. לעומת זאת, סטריאוטיפיליה שורה קצרה יותר בתאי השיער הפנימיים וכל הסטריאוטיליה של תאי השיער החיצוניים יש קוטרים סביב 100-200 ננומטר ולא ניתן לדמיין עם מיקרוסקופיה אופטית⁵. למרות ההתקדמות האחרונה בהדמיה ברזולוציית-על, מגבלה בסיסית זו נמשכת בכל הדמיה אופטית ללא תוויות. כל הטכניקות הנוכחיות הזמינות מסחרית סופר רזולוציה דורשות סוג כלשהו של מולקולות פלואורסצנטיות⁶, אשר מגביל את היישומים שלהם. בנוסף למגבלות בשל הצורך במולקולות ספציפיות מתויגות פלואורסצנטיות, הוכח כי חשיפה להקרנת אור אינטנסיבית גורמת לנזק תאי ועשויה להשפיע על תהליכים תאיים, המהווה חיסרון גדול בחקר תאים חיים⁷.

הידע הנוכחי שלנו על הפרטים האולטרה-מבניים של חבילות סטריאציליה של תאי שיער הושג בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה אלקטרוניות (EM) שונות, כגון סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), שבר בהקפאה EM, ולאחרונה עם טכניקות תלת-ממד כגון חתך סדרתי עם קרן יונים ממוקדת או טומוגרפיה קריו-EM^{8,9,10,11,12,13, 14,15,16.} למרבה הצער, כל טכניקות EM אלה דורשות כימי או cryofixation של המדגם. בהתאם לסולם הזמן של התופעות, דרישה זו הופכת את המחקר של התהליכים הדינמיים בקצות סטריאוטיפיליה לבלתי אפשרי או מאוד אינטנסיבי בעבודה.

נעשו מאמצים מוגבלים לדמיין חבילות שיער של תאי שיער חיים עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM)^17,18. מכיוון ש-AFM פועלת בפתרונות פיזיולוגיים, היא יכולה, בתיאוריה, לדמיין שינויים דינמיים בחבילות הסטריאוטיליה של תאי שיער חיים לאורך זמן. הבעיה נעוצה בעקרונות של AFM ברזולוציה גבוהה, המרמזת על מגע פיזי מסוים בין הבדיקה AFM לבין המדגם, אפילו במצב “הקשה” הכי פחות מזיק¹⁹. כאשר הגשושית AFM נתקלת בסטריאוטיניום, היא בדרך כלל מתרסקת עליו, ופוגעת במבנה של חבילת השיער. כתוצאה מכך, טכניקה זו אינה מתאימה לדמיין חיים, או אפילו קבוע, תאי שיער חבילות^17,18. הבעיה עשויה להיות הקלה חלקית באמצעות בדיקה AFM בצורת כדור גדול המטיל רק כוחות הידרודינמיים על פני השטח של המדגם²⁰. עם זאת, למרות בדיקה כזו מתאימה באופן אידיאלי כדי לבדוק תכונות מכניות של המדגם²¹, הוא מספק רק רזולוציה תת מיקרומטר בעת הדמיה האיבר של Corti²² ועדיין חל על המדגם כוח שעשוי להיות משמעותי עבור חבילות סטריאוטיפיליה רגיש מאוד.

סריקת מיקרוסקופיית מוליכת יונים (SICM) היא גרסה של מיקרוסקופיית בדיקה סריקה המשתמשת בגשושית פיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה מוליכת²³. SICM מזהה את פני השטח כאשר הפיפטה מתקרבת לתא והזרם החשמלי דרך הפיפטה פוחת. מאז זה קורה הרבה לפני נגיעה בתא, SICM מתאים באופן אידיאלי עבור הדמיה ללא מגע של תאים חיים בפתרון פיזיולוגי²⁴. הרזולוציה הטובה ביותר של SICM היא בסדר של ננומטר יחיד, המאפשר פתרון מתחמי חלבון בודדים בקרום הפלזמה של תא חי²⁵. עם זאת, בדומה לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, SICM מסוגל לדמיין רק משטחים שטוחים יחסית. התגברנו על מגבלה זו על ידי המצאת מיקרוסקופ מוליכת יון בדיקה מקפץ (HPICM)²⁶, שבו הננו-צינור מתקרב לדגימה בכל נקודת הדמיה(איור 1A). באמצעות HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוסיליה בתאי שיער שמיעתיים חיים ברזולוציה ננומטרית²⁷.

יתרון בסיסי נוסף של טכניקה זו הוא כי HPICM הוא לא רק כלי הדמיה. בניגוד לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, הבדיקה HPICM / SICM היא אלקטרודה הנמצאת בשימוש נרחב בפיזיולוגיה של תאים להקלטות חשמליות ואספקה מקומית של גירויים שונים. פעילות ערוץ יון אינה מפריעה בדרך כלל להדמיית HPICM, מכיוון שהזרם הכולל באמצעות הבדיקה HPICM הוא מספר סדרי גודל גדולים יותר מהזרם החוץ-תאי שנוצר על-ידי ערוצי היון הגדולים ביותר²⁵. עם זאת, HPICM מאפשר מיקום מדויק של nanopipette מעל מבנה של עניין והקלטת מהדק תיקון בערוץ יחיד לאחר מכן ממבנה זה²⁸. כך השגנו את ההקלטות הראשוניות הראשונות של פעילות ערוץ יחיד בקצות סטריוציליה של תא השיער החיצוני²⁹. ראוי להזכיר כי אפילו זרם גדול דרך nanopipette לא יכול לייצר שינויים משמעותיים של הפוטנציאל על פני קרום הפלזמה בשל דלף חשמלי עצום של המדיום החוץ תאי. עם זאת, ערוצי יונים בודדים יכולים להיות מופעלים באופן מכני על ידי זרימת נוזל דרך nanopipette³⁰ או כימית על ידי יישום מקומי של אגוניסט³¹.

ב-HPICM, התמונה נוצרת כאשר ננו-אפיפט ניגש ברצף לדגימה בשלב מסוים, נסוג ואז נע בכיוון רוחבי כדי לחזור על הגישה (איור 1A). מגבר מהדק תיקון מחיל כל הזמן מתח על חוט AgCl בפיפטה (איור 1B) כדי ליצור זרם של ~ 1 nA בתמיסת האמבטיה. הערך של זרם זה כאשר הפיפטה רחוקה מפני השטח של התא נקבע כזרם ייחוס(אני_חוזר, איור 1C). לאחר מכן, הפיפטה נעה בציר Z כדי להתקרב לדגימה עד שהזרם יופחת בסכום שהוגדר מראש על-ידי המשתמש (setpoint), בדרך כלל 0.2%-1% _מהנציג של I (איור 1C, מעקב עליון). לאחר מכן המערכת שומרת ערך Z ברגע זה כגובה המדגם, יחד עם קואורדינטות X ו- Y של נקודת הדמיה זו. לאחר מכן, הפיפטה נסוגה מפני השטח(איור 1C,מעקב תחתון) במהירות שהוגדרה על ידי המשתמש, בדרך כלל 700-900 ננומטר/ms. לאחר הנסיגה, הפיפטה (או, במקרה שלנו, המדגם – ראה איור 1B) מועבר לרוחב לנקודת ההדמיה הבאה, מתקבל ערך זרם ייחוס חדש, והפפטה שוב מתקרבת לדגימה, חוזרת על התהליך. תנועת X-Y של הפיפטה עדיפה במערך מיקרוסקופ זקוף המשמש בדרך כלל להקלטות של זרמי המכנוטרנסדוקציה של תאי השיער. בהגדרה זו, הבדיקה HPICM מתקרבת לחבילות תאי השיער לא מלמעלה אלא בזווית³². עם זאת, הרזולוציה הטובה ביותר של הדמיית HPICM מושגת במערך מיקרוסקופ הפוך (איור 1A,B),שבו התנועה של המדגם בכיווני X-Y היא דה-מצמיד מ Z-תנועה של nanopipette, ובכך ביטול חפצים מכניים פוטנציאליים.

באמצעות HPICM, השגנו תמונות טופוגרפיות של חבילות סטריאוטיפיליה פנימיות וחתריות של עכבר וחולדה, ואפילו דמיינו את הקשרים בין הסטריאוטיפיליה בקוטר של כ -5 ננומטר^26,27. ההצלחה של הדמיית חבילת תאי שיער בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. ראשית, הרעש (השונות) של זרם הננו-צינור צריך להיות קטן ככל האפשר כדי לאפשר את נקודת הקבע הנמוכה ביותר האפשרית עבור הדמיית HPICM. נקודת קבע נמוכה מאפשרת לגשושית HPICM “לחוש” משטח סטריוציליה במרחק גדול יותר ובכל זווית לגישת הגשושית, ובאופן מפתיע, משפרת את רזולוציית X-Y של הדמיית HPICM (ראה דיון). שנית, יש להקטין את התנודות והסחף במערכת לפחות מ -10 ננומטר, שכן הם תורמים ישירות לחפצי ההדמיה. לבסוף, למרות שגשושית HPICM ושלב הדגימה מועברות בצירי Z ו- X-Y על ידי מפעילי פיזו מכוילים הנשלטים על ידי משוב שיש להם דיוק של ננומטר יחיד או טוב יותר, הקוטר של קצה הננופיט קובע את התפשטות הזרם (נפח חישה) ומכאן הרזולוציה (איור 1A). לכן, לפני הדמיית תאי שיער חיים, חשוב למשוך את פיפטות נאותה, להגיע לרזולוציה הרצויה עם דגימות כיול, ולהשיג רעש נמוך במערכת ההקלטה.

במשך כמה עשורים לפחות, טכניקת SICM לא הייתה זמינה מסחרית והיא מתפתחת על ידי מעבדות מעטות בלבד בעולם עם המעבדה המובילה של פרופ ‘קורצ’ב במכללה הקיסרית (בריטניה). לאחרונה, מספר מערכות SICM הפכו לזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים), כולן מבוססות על עקרונות HPICM המקוריים. עם זאת, חבילות סטריאציליה הדמיה בתאי השיער דורשת מספר שינויים מותאמים אישית כי הם מאתגרים מבחינה טכנית (או אפילו בלתי אפשרי) במערכות סגורות “מוכן ללכת”. לכן, יש צורך בשילוב רכיבים מסוימים. מכיוון שהגדרת HPICM מייצגת אסדת מהדק תיקון עם דרישות רטט וסחף מחמירות יותר ותנועה מונעת פיזו של גשושית HPICM והמדגם (איור 1D), שילוב זה קל יחסית לכל חוקר, הבקיא בהידוק תיקונים. עם זאת, מדען ללא רקע מתאים בהחלט צריך קצת הכשרה אלקטרופיזיולוגיה ראשונה. למרות האתגרים שנותרו כגון הגדלת מהירות ההדמיה (ראה דיון), הצלחנו לדמיין חבילות סטריאציליה בתאי שיער חיים ברזולוציה ננומטרית מבלי לפגוע בהם.

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה מוצלחת של HPICM של חבילות תאי שיער שמיעתיים חיים בחולדה צעירה לאחר הולדות או בגולשי שבלול עכברים צעירים באמצעות המערכת המותאמת אישית שלנו. הרכיבים המשולבים מפורטים בטבלת החומרים. המאמר מתאר גם בעיות נפוצות שניתן להיתקל בהן וכיצד לפתור אותן.