聴覚毛髪細胞の立体束は、光学顕微鏡で視覚化するのに十分な大きさであり、パッチクランプ実験で生細胞で偏向するという事実にもかかわらず、先端リンクなどの伝達機構の必須の構造成分は、死細胞の電子顕微鏡検査でのみ画像化することができた。哺乳類聴覚毛細胞において、伝達機械は先端リンクの下端に位置し、すなわち、短い列立体¹の先端に位置し、立体^2,3の先端で信号を通して局所的に調節される。しかし、生きた毛髪細胞のこの場所での表面構造のラベルフリーイメージングは、立体の小さなサイズのために不可能です。

哺乳類の内毛細胞には、内毛細胞と外毛細胞の2種類の聴覚感覚細胞があります。内側の毛細胞では、立体は外毛細胞⁴に比べて長く、より厚い。立体の第1および第2列は、マウスまたはラットの内側の毛細胞の直径300〜500 nmを有する。光の回折により、ラベルフリー光学顕微鏡で達成可能な最大解像度は約200nmです。したがって、内側の毛細胞束の第1および第2列内の個々の立体の可視化は、光学顕微鏡検査で比較的容易である。対照的に、内側の毛細胞および外髪細胞のすべての立体体の短い立体は、100〜200nmの周りに直径を有し、光学顕微鏡⁵では視覚化できない。超解像イメージングの最近の進歩にもかかわらず、この基本的な制限は、任意の光学ラベルフリーイメージングに残っています。現在市販されているすべての超分解能技術は、その用途を制限する蛍光分子⁶のいくつかの並べ替えを必要とします。特定の蛍光的にタグ付けされた分子の必要性による制限に加えて、強烈な光照射への暴露は細胞損傷を誘発し、細胞プロセスに影響を与える可能性が示されているが、これは生細胞⁷を研究する際に大きな欠点である。

毛髪細胞立体線の超構造詳細に関する我々の現在の知識は、主に走査型電子顕微鏡(SEM)、透過電子顕微鏡(TEM)、凍結破壊EM、および最近ではイオンビームまたはクライオEMトモグラフィーまたはクライオEMトモグラフィーを用いたシリアル断面化などの3D技術を用いて、様々な電子顕微鏡(EM)技術で得られた^{。 14、15、16}.残念ながら、これらのすべてのEM技術は、サンプルの化学的または凍結を必要とします。現象の時間スケールに応じて、この要件は、ステレオ繊毛の先端での動的プロセスの研究を不可能または非常に労働集約的に行います。

原子間力顕微鏡(AFM)17,18を用いた生毛細胞の毛束の画像化に限られた努力がなされている。AFMは生理学的な溶液で動作するので、理論的には、時間の経過とともに生きた毛髪細胞の立体束の動的変化を視覚化することができる。問題は、AFMプローブとサンプルの間の特定の物理的接触を意味する高解像度AFMの原理^{にあります。}AFMプローブがステレオシリウムに遭遇すると、通常はクラッシュし、毛束の構造を損傷します。その結果、この技術は、生きている、あるいは固定された、毛細胞束^17、18を視覚化するのに適していない。この問題は、試料²⁰の表面に流体力のみを加える大きなボール型AFMプローブを用いることで部分的に緩和され得る。しかし、このようなプローブはサンプル²¹の機械的特性をテストするのに理想的であるが、コルティ²²の器官を撮像する場合にはサブマイクロメートルの解像度しか提供せず、依然として高感度の立体束に対して実質的な力をサンプルに適用する。

走査イオン伝導顕微鏡(SICM)は、導電性溶液²³を充填したガラスピペットプローブを用いた走査プローブ顕微鏡のバージョンである。SICMは、ピペットが細胞に近づくと表面を検出し、ピペットを通して電流が減少します。これは細胞に触れる前によく起こっているので、SICMは生理学的溶液²⁴中の生細胞の非接触イメージングに理想的に適している。SICMの最良の解像度は、単一ナノメートルの順序で、生細胞²⁵の形質膜で個々のタンパク質複合体を解決することができます。しかし、他の走査プローブ技術と同様に、SICMは比較的平坦な表面のみを画像化することができます。この限界を克服するために、ホッピングプローブイオン伝導顕微鏡(HPICM)26、ナノピペットが各イメージングポイントでサンプルに近づく(図1A)。HPICMを用いて、ナノスケール分解能²⁷の生きた聴覚毛細胞の立体束を画像化することができた。

この技術のもう一つの基本的な利点は、HPICMが単なるイメージングツールではないということです。他の走査プローブ技術とは対照的に、HPICM/SICMプローブは、様々な刺激の電気記録および局所送達のために細胞生理学で広く使用されている電極である。イオンチャネル活性は、通常、HPICMイメージングを妨げないが、HPICMプローブを介した総電流は、最大のイオンチャネル²⁵によって生成された細胞外電流より数桁大きいからである。しかし、HPICMは、この構造²⁸からの目的の構造とその後の単一チャネルパッチクランプ記録に対するナノピペットの正確な位置決めを可能にする。このようにして、外毛細胞ステレオ繊毛²⁹の先端で単一チャネル活動の最初の予備記録を得た。ナノピペットを通る大電流でさえ、細胞外媒体の膨大な電気シャントのために、形質膜全体の電位の有意な変化を生じることができないことは言及する価値があります。しかし、個々のイオンチャネルは、アゴニスト³¹の局所的な適用によってナノピペット³⁰を通る液体の流れによって機械的に活性化することができる。

HPICMでは、ナノピペットがサンプルを順次に近づいてサンプルを一点で進み、後退し、横方向に移動してアプローチを繰り返すと、画像が生成されます(図1A)。パッチクランプアンプは、ピペット(図1B)のAgClワイヤーに常に電圧を適用し、浴液中に〜1nAの電流を発生させます。ピペットがセルの表面から離れている場合のこの電流の値は、参照電流として決定されます(I_ref,図1C)。次に、ピペットはZ軸内を移動して、電流がユーザによって事前定義された量(設定点)によって減少するまでサンプルに近づくため、通常はI_refの0.2%-1%(図1C、上トレース)を示す。システムは、この時点での Z 値をサンプルの高さとして、このイメージング ポイントの X 座標と Y 座標と共に保存します。次に、ピペットは、ユーザーが定義する速度(通常は700-900 nm/ms)で表面(図1C、下のトレース)から引き込まれる。引き込み後、ピペット(または、我々の場合、サンプル-図1Bを参照)が次のイメージングポイントに横に移動し、新しい基準電流値が得られ、ピペットが再びサンプルに近づき、プロセスを繰り返します。ピペットのX-Y運動は、毛細胞メカノトランスダクション電流の記録に通常使用される直立顕微鏡セットアップで好ましい。この設定では、HPICM プローブは、上からではなく、角度³²でヘア セル バンドルに近づきます。しかし、HPICMイメージングの最良の解像度は、反転顕微鏡のセットアップ(図1A、B)で達成され、X-Y方向のサンプルの動きはナノピペットのZ運動から結合され、潜在的な機械的アーティファクトを排除します。

HPICMを用いて、マウスおよびラットの内毛および外毛細胞の立体構造束の地形画像を得て、直径^26、27の約5nmの立体間のリンクを視覚化した。この技術によるヘアセルバンドルイメージングの成功は、いくつかの要因に依存します。まず、ナノピペット電流のノイズ(分散)は、HPICMイメージングの可能な限り低い設定点を可能にする限り小さくする必要があります。低い設定値を設定すると、HPICMプローブは、より大きな距離で、プローブアプローチに対して任意の角度で立体表面を「感知」することができ、驚くべきことに、HPICMイメージングのX-Y解像度が向上します(説明を参照)。第二に、システム内の振動とドリフトは、イメージングアーティファクトに直接寄与するため、10nm未満に減少する必要があります。最後に、HPICMプローブと試料ステージは、単一ナノメートル以上の精度を有する較正されたフィードバック制御圧電器によってZ軸とX-Y軸で移動する場合でも、ナノピペット先端の直径は電流(感知量)の広がりとそれゆえに分解能(図1A)を決定する。したがって、生きた毛細胞をイメージングする前に、適切なピペットを引っ張り、キャリブレーションサンプルで所望の解像度に到達し、記録システムで低ノイズを達成することが重要です。

少なくとも数十年の間、SICM技術は商業的に入手可能ではなく、インペリアル・カレッジ(英国)のコルチェフ教授の主要な研究室で世界のいくつかの研究室によって開発されています。最近では、いくつかのSICMシステムが市販されるようになった( 材料表を参照)、そのすべてが元のHPICM原則に基づいています。しかし、ヘアセル内のステレオシリアバンドルをイメージングするには、クローズドの「すぐに使える」システムでは技術的に困難な(あるいは不可能な)いくつかのカスタム修正が必要です。そのため、コンポーネントの統合が必要になります。HPICMのセットアップはより厳しい振動および漂流の条件およびHPICMの調査およびサンプル(図1D)の圧造によって動く動きを有するパッチクランプ装置を表すので(図1D)、この統合は、パッチクランプに熟練している研究者にとって比較的容易である。しかし、適切な背景を持たない科学者は、間違いなく最初に電気生理学のいくつかの訓練を必要とします。イメージングの速度を上げるなどの課題が残っていますが( 議論参照)、私たちは生きた毛髪細胞の立体束をナノスケールの解像度で損傷を与えることなく画像化することができました。

本論文では、当社のカスタムシステムを用いて、若い出生後ラットまたはマウス人工内葉植物の生聴覚毛細胞束のHPICMイメージングを成功させるための詳細なプロトコルを提示する。統合されたコンポーネントは、 の一覧を参照してください。また、発生する可能性のある一般的な問題とそのトラブルシューティング方法についても説明します。