Baroreflexen är en hjärtfrekvensregleringsmekanism av det autonoma nervsystemet som svar på blodtrycksförändringar. Vi beskriver en kirurgisk teknik för att implantera telemetrisändare för kontinuerlig och samtidig mätning av elektrokardiogram och blodtryck hos möss. Detta kan bestämma spontan baroreflexkänslighet, en viktig prognostisk markör för hjärt-kärlsjukdom.
Blodtryck (BP) och hjärtfrekvens (HR) styrs båda av det autonoma nervsystemet (ANS) och är nära sammanflätade på grund av reflexmekanismer. Baroreflexen är en viktig homeostatisk mekanism för att motverka akuta, kortvariga förändringar i arteriellt BP och för att upprätthålla BP i ett relativt smalt fysiologiskt intervall. BP känns av baroreceptorer belägna i aortabågen och carotid sinus. När BP förändras överförs signaler till centrala nervsystemet och kommuniceras sedan till de parasympatiska och sympatiska grenarna i det autonoma nervsystemet för att justera HR. En ökning av BP orsakar en reflexminskning av HR, en minskning av BP orsakar en reflexökning av HR.
Baroreflexkänslighet (BRS) är det kvantitativa förhållandet mellan förändringar i arteriell BP och motsvarande förändringar i HR. Kardiovaskulära sjukdomar är ofta förknippade med nedsatt baroreflexfunktion. I olika studier har minskat BRS rapporterats vid t.ex. hjärtsvikt, hjärtinfarkt eller kranskärlssjukdom.
Bestämning av BRS kräver information från både BP och HR, som kan registreras samtidigt med telemetriska enheter. Det kirurgiska ingreppet beskrivs med början med införandet av trycksensorn i den vänstra halspulsådern och positionering av dess spets i aortabågen för att övervaka artärtrycket följt av den subkutana placeringen av sändaren och EKG-elektroderna. Vi beskriver också postoperativ intensivvård och smärtstillande behandling. Efter en tvåveckorsperiod av återhämtning efter operationen utförs långsiktiga EKG- och BP-inspelningar på medvetna och ohämmade möss. Slutligen inkluderar vi exempel på högkvalitativa inspelningar och analys av spontan baroreceptorkänslighet med hjälp av sekvensmetoden.
Den arteriella baroreceptorreflexen är det viktigaste återkopplingskontrollsystemet hos människor som ger en kortvarig – och möjligen också långsiktig 1,2 – kontroll av arteriellt blodtryck (ABP). Denna reflex buffrar störningar i BP som uppstår som svar på fysiologiska eller miljömässiga triggers. Det ger snabba reflexförändringar i hjärtfrekvens, slagvolym och totalt perifert arteriellt motstånd. Reflexen har sitt ursprung i sensoriska nervändar i aortabågen och halspulsådern. Dessa nervterminaler utgör de arteriella baroreceptorerna. Somata av nervterminaler i aortabågen är belägna i nodose ganglion medan de av nervterminaler i carotid sinus är belägna i petrosal ganglion. Reflexen utlöses av en ökning av blodtrycket, vilket sträcker sig och aktiverar baroreceptornervterminalerna (figur 1A). Aktivering resulterar i aktionspotentialvolleys som överförs centralt via afferenta aortadepressivor och carotid sinusnerver till kardiovaskulära hjärnstamkärnor såsom kärnan tractus solitarii och dorsala kärnan i vagusnerven. Förändringar i afferent nervaktivitet modulerar i sin tur den autonoma efferenta aktiviteten. Ökad aktivitet av baroreceptornerver minskar sympatisk och ökar parasympatisk nervaktivitet. Således är konsekvenserna av aktivering av baroreceptorer en minskning av hjärtfrekvens, hjärtminutvolym och vaskulär resistans som tillsammans motverkar och buffrar ökningen av blodtrycket3. Däremot ökar minskad aktivitet av baroreceptornerver sympatisk och minskar parasympatisk nervaktivitet, vilket ökar hjärtfrekvensen, hjärtminutvolymen och vaskulär resistans och därmed motverkar minskningen av blodtrycket.
Många studier på människor och djur har visat att baroreceptorreflexen kan justeras under fysiologiska förhållanden som träning4, sömn5, värmestress6 eller graviditet7. Dessutom finns det bevis för att baroreflexen är kroniskt nedsatt vid hjärt-kärlsjukdomar, såsom högt blodtryck, hjärtsvikt, hjärtinfarkt och stroke. Faktum är att baroreflexdysfunktion också används som en prognostisk markör vid flera hjärt-kärlsjukdomar 8,9,10. Vidare är dysfunktion av baroreflexen också närvarande vid störningar i ANS. Med tanke på baroreceptorreflexens betydelse för hälsa och sjukdomstillstånd är in vivo-uppskattning av denna reflex en viktig komponent i autonom och kardiovaskulär forskning med vissa allvarliga kliniska konsekvenser.
Genetiska muslinjer är viktiga verktyg inom kardiovaskulär forskning. In vivo-studier av sådana muslinjer ger värdefulla insikter i kardiovaskulär fysiologi och patofysiologi och fungerar i många fall som prekliniska modellsystem för kardiovaskulära sjukdomar. Här tillhandahåller vi ett protokoll för telemetrisk in vivo EKG- och BP-inspelning i medvetna, ohämmade, fritt rörliga möss och beskriver hur baroreflexkänslighet kan bestämmas från dessa inspelningar med hjälp av sekvensmetoden (Figur 1B). Den tillämpade metoden kallas sekvensmetoden, eftersom beat-to-beat-serien av systoliska BP (SBP) och RR-intervall screenas för korta sekvenser av tre eller flera slag under spontan ökning eller minskning av SBP med reflexanpassning av HR. Denna metod är guldstandarden för baroreflexkänslighetsbestämning eftersom endast spontana reflexmekanismer undersöks. Tekniken är överlägsen äldre tekniker som involverade invasiva procedurer såsom injektion av vasoaktiva läkemedel för att inducera BP-förändringar.
Figur 1: Schematisk representation av baroreflex- och baroreflexkänslighetsbedömningen med hjälp av sekvensmetoden . (A) Baroreflexens förlopp under en akut blodtryckshöjning. En kortvarig ökning av ABP känns av baroreceptorer som ligger i aortabågen och carotid sinus. Denna information överförs till centrala nervsystemet och inducerar en minskning av sympatisk nervaktivitet parallellt med en ökning av parasympatisk aktivitet. Frisättning av acetylkolin från nervändar belägna i sinoatriella nodregionen inducerar en minskning av den andra budbäraren cAMP i sinoatriella nodpacemakerceller och därmed en minskning av hjärtfrekvensen. En kortvarig minskning av blodtrycket har motsatt effekt. (B) Schematiska BP-spår under en uppåtsekvens (övre vänstra panelen) och nedåtsekvens (övre högra panelen) av tre på varandra följande slag. En uppåtsekvens är associerad med en parallell ökning av RR-intervall (nedre vänstra panelen) vilket motsvarar en minskning av HR. En nedåtsekvens är associerad med en parallell minskning av RR-intervall (nedre högra panelen) vilket motsvarar en ökning av HR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Metodens betydelse i förhållande till alternativa metoder
I detta arbete presenterar vi ett detaljerat protokoll för att kvantifiera spontan BRS med hjälp av sekvensmetoden. Detta tillvägagångssätt använder spontana BP- och reflex-HR-förändringar som mäts med EKG- och BP-telemetri. Fördelen med denna metod är att båda parametrarna kan registreras i medvetna, fritt rörliga, ohämmade djur utan att störa djur genom att gå in i rummet där mätningarna utförs eller till och med genom fysisk interaktion som krävs för injektion av droger. Denna punkt är mycket viktig eftersom det tydligt har visats att sådana störningar allvarligt stör HR- och BP-inspelningar. Till exempel kräver injektion av läkemedel fixering av mössen, vilket orsakar ett maximalt stressrespons som ökar HR upp till 650-700 bpm. För att kringgå dessa stressreaktioner har BRS tidigare bestämts hos sövda möss. Standardanestetika som används inom veterinärmedicin såsom ketamin/xylazin eller isofluran inducerar dock bradykardi och påverkar autonoma reflexsvar, vilket begränsar giltigheten av dessa metoder och tolkningen av resultaten. För att delvis övervinna dessa begränsningar användes implanterbara läkemedelsleveransanordningar, dvs osmotiska pumpar, som kan frigöra läkemedel i bukhålan. Med osmotiska pumpar är det emellertid inte möjligt att applicera en bolus av en definierad dos av läkemedel som begränsar tillämpningen av sådana anordningar. Alternativt komplexa infusionskatetrar17 kan implanteras i möss för att administrera läkemedel. Dessa katetrar är dock svåra att hantera och kräver kirurgiska färdigheter jämförbara med dem som krävs för implantation av telemetriska enheter, samtidigt som de ger mindre vetenskapligt resultat jämfört med mätningar av spontan BRS. Förutom de tekniska problemen i samband med mätning av BRS med injektion av läkemedel, finns det vissa begränsningar relaterade till läkemedelsverkan i sig. Traditionella metoder för att bestämma BRS inkluderar bolusinjektioner av vasoaktiva läkemedel. Bolusinjektion av vasokonstriktorer (t.ex. fenylefrin) eller vasodilatatorer (t.ex. natriumnitroprussid) har dock ansetts vara en överdriven och icke-fysiologisk stimulans för reflexmässig HR-anpassning till förändringar i BP18. Spontan aktivitet hos baroreceptorreflexen kan också kvantifieras med spektralmetoder. En av dessa metoder bedömer BRS i frekvensdomänen genom beräkning av förhållandet mellan förändringar i HR och förändringar i blodtryck i ett specifikt frekvensband18,19. Andra spektrala metoder innefattar bestämning av överföringsfunktionen hos BP och HR eller kvantifiering av koherensen mellan BP och HR20,21. Dessa metoder kräver också telemetrisk insamling av spontana BP- och HR-parametrar och även om de är lämpliga för bestämning av spontan BRS, kräver de intensiva beräkningsverktyg och är utmanande att tillämpa. Dessutom lider alla spektralmetoder av begränsningen att icke-stationära signaler utesluter tillämpning av spektralmetoder. I synnerhet kan spektraltoppar inducerade av andningsrytmer minskas hos mänskliga patienter genom att be patienten att sluta andas, medan detta uppenbarligen inte är möjligt hos möss. Därför är signal-brusförhållandet ofta ganska lågt hos möss. Med tanke på begränsningarna av de metoder som diskuterats ovan föredrar vi sekvensmetoden för att bestämma BRS hos möss. En stor fördel med denna metod är det faktum att det är en icke-invasiv teknik som ger data om spontan BRS under verkliga förhållanden22. En ytterligare viktig punkt är att varaktigheten av sekvenser som analyseras med sekvensmetoden är ganska kort, med 3-5 slag. Reflexreglering av HR av vagusnerven är mycket snabb och väl inom tidsramen för dessa sekvenser. Därför är sekvensmetoden väl lämpad för att utvärdera vagusnervens bidrag till BRS. Däremot är reglering av det sympatiska nervsystemet mycket långsammare. Faktum är att under dessa korta sekvenser kan aktiviteten i det sympatiska nervsystemet antas vara nästan konstant. Därför är metoden anpassad för att selektivt detektera reflexförändringar hos HR som drivs av vagusnervaktivitet.
Tolkning av BRS-data
För tolkningen av BRS-dysfunktion eller BRS-data i sig är det viktigt att överväga de individuella funktionella nivåerna som är involverade i baroreceptorreflexen. På neuronal nivå kan afferenta, centrala eller efferenta komponenter i reflexen påverkas23. På kardiovaskulär nivå kan minskad eller överdriven respons hos den sinoatriella noden till ANS-ingång vara närvarande11,24. En förändring på varje nivå kan leda till förändringar i BRS. För att dissekera huruvida neuronala och/eller hjärtmekanismer är ansvariga för observerade förändringar i BRS, kan hjärt- eller neuronspecifik gendeletion, knock down eller genredigeringsmetoder användas.
Kritiska steg i protokollet
Det mest sofistikerade och kritiska steget i detta protokoll är beredningen och kanyleringen av vänster halspulsåder (steg 2.3). Spänningen i den kaudala ocklusionssuturen måste vara tillräckligt hög för att helt stoppa blodflödet före kannulation. Annars kan även ett litet läckage av blod under kanylering allvarligt begränsa synligheten eller till och med få musen att blöda ihjäl. Kanylering bör lyckas vid första försöket. Men vid misslyckande av det första försöket är det fortfarande möjligt att försiktigt försöka igen cannulation.
Mittlinjens snitt och subkutan tunnel från halsen till vänster flank (steg 2.3) måste vara tillräckligt stora för att enkelt föra in sändaren utan kraft men måste också vara så liten som möjligt för att hålla sändaren på plats. Annars måste man låsa den på plats med suturmaterial eller vävnadslim. Eftersom möss har en mycket känslig hud kan nekros i huden uppstå om tunneln för sändaren är för liten.
Om EKG-elektroderna är för långa för att passa in i den subkutana tunneln (steg 2.4) är det nödvändigt att bilda en ny spets genom att förkorta elektroden till rätt längd. Elektroden måste ligga platt mot kroppen över hela ledningens längd. För långa elektroder kommer att störa djuren och de kommer att försöka öppna såret för att ta bort sändaren, vilket resulterar i risk för vävnadsirritation och sårdehiscens. Ledningar som är för korta kan naturligtvis inte förlängas och det kan vara så att elektroderna i detta fall inte kan placeras på ett sådant sätt att de motsvarar Einthoven II-konfigurationen. Vi rekommenderar därför att bestämma den optimala längden på EKG-ledningarna på en död mus av samma kön, vikt och genetisk bakgrund.
Möss bör ges en längre återhämtningstid efter implantation av transmittorer om de inte har en normal dygnsrytm och detta inte är fenotypen för den muslinje som studeras (steg 2.7). En annan orsak till störd dygnsrytm kan vara otillräcklig akustisk isolering av djuranläggningen eller personal som kommer in i rummet under mätningen.
EKG-, BP- och BRS-dataanalys är rakt fram (steg 2.8). Det mest kritiska steget är att utesluta ektopisk beats, sinuspauser, arytmiska episoder eller sektioner med signaler av låg kvalitet från dataanalys.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen [FE 1929/1-1 och WA 2597/3-1]. Vi tackar Sandra Dirschl för utmärkt teknisk hjälp och Julia Rilling för veterinärrådgivning.
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
Forceps – Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
Forceps – straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
Data acquisition and analysis | Source | ||
DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |