Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice

Ren&#233; D. R&#246;tzer; Verena F. Brox; Konstantin Hennis; Stefan B. Thalhammer; Martin Biel; Christian Wahl-Schott; Stefanie Fenske

doi:10.3791/62101

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Medicina

Implantatie van gecombineerde telemetrische ECG- en bloeddruktransmitters om spontane baroreflexgevoeligheid bij bewuste muizen te bepalen

Published: February 14, 2021

doi:

10.3791/62101

René D. Rötzer¹, Verena F. Brox¹, Konstantin Hennis¹, Stefan B. Thalhammer¹, Martin Biel^1,2, Christian Wahl-Schott³, Stefanie Fenske^1,2

¹Center for Integrated Protein Science (CIPS-M) and Center for Drug Research, Department of Pharmacy,Ludwig-Maximilians-Universität München, ²German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance, ³Hannover Medical School,Institute for Neurophysiology

Summary

De baroreflex is een hartslagregulatiemechanisme door het autonome zenuwstelsel als reactie op bloeddrukveranderingen. We beschrijven een chirurgische techniek om telemetriezenders te implanteren voor continue en gelijktijdige meting van elektrocardiogram en bloeddruk bij muizen. Dit kan spontane baroreflexgevoeligheid bepalen, een belangrijke prognostische marker voor hart- en vaatziekten.

Abstract

Bloeddruk (BP) en hartslag (HR) worden beide gecontroleerd door het autonome zenuwstelsel (ANS) en zijn nauw met elkaar verweven door reflexmechanismen. De baroreflex is een belangrijk homeostatisch mechanisme om acute, kortdurende veranderingen in arteriële BP tegen te gaan en BP in een relatief smal fysiologisch bereik te houden. BP wordt waargenomen door baroreceptoren in de aortaboog en de sinus carotis. Wanneer BP verandert, worden signalen doorgegeven aan het centrale zenuwstelsel en vervolgens doorgegeven aan de parasympathische en sympathische takken van het autonome zenuwstelsel om HR aan te passen. Een stijging van de BP veroorzaakt een reflexafname van de HR, een daling van de BP veroorzaakt een reflextoename van de HR.

Baroreflexsensitiviteit (BRS) is de kwantitatieve relatie tussen veranderingen in arteriële BP en overeenkomstige veranderingen in HR. Hart- en vaatziekten worden vaak geassocieerd met een verminderde baroreflexfunctie. In verschillende onderzoeken is verminderde BRS gemeld bij bijvoorbeeld hartfalen, myocardinfarct of coronaire hartziekte.

Bepaling van BRS vereist informatie van zowel BP als HR, die gelijktijdig kan worden vastgelegd met behulp van telemetrische apparaten. De chirurgische procedure wordt beschreven vanaf het inbrengen van de druksensor in de linker halsslagader en de positionering van de punt in de aortaboog om de arteriële druk te controleren, gevolgd door de subcutane plaatsing van de transmitter en ECG-elektroden. We beschrijven ook postoperatieve intensive care en analgetische behandeling. Na een periode van twee weken van herstel na de operatie worden langdurige ECG- en BP-opnames uitgevoerd bij bewuste en ongeremde muizen. Ten slotte nemen we voorbeelden op van opnames van hoge kwaliteit en de analyse van spontane baroreceptorgevoeligheid met behulp van de sequentiemethode.

Introduction

De arteriële baroreceptorreflex is het belangrijkste feedbackcontrolesysteem bij de mens dat zorgt voor een kortdurende – en mogelijk^{ook langere} termijn ^1,2 – controle van de arteriële bloeddruk (ABP). Deze reflex buffert verstoringen in BP die optreden als reactie op fysiologische of omgevingstriggers. Het biedt snelle reflexveranderingen in hartslag, slagvolume en totale perifere arteriële weerstand. De reflex ontstaat in sensorische zenuwuiteinden in de aortaboog en halsslagaders. Deze zenuwuiteinden vormen de arteriële baroreceptoren. De somata van zenuwuiteinden in de aortaboog bevinden zich in het nodose ganglion, terwijl die van zenuwuiteinden in de sinus carotis zich in het petrosale ganglion bevinden. De reflex wordt veroorzaakt door een verhoging van de bloeddruk, die de baroreceptorzenuwuiteinden rekt en activeert (figuur 1A). Activering resulteert in actiepotentiaal volleys die centraal via de afferente aortadepressor en carotis sinuszenuwen worden overgedragen naar cardiovasculaire hersenstamkernen zoals de nucleus tractus solitarii en de dorsale kern van de nervus vagus. Veranderingen in afferente zenuwactiviteit moduleren op hun beurt de autonome efferente activiteit. Verhoogde activiteit van baroreceptorzenuwen vermindert sympathisch en verhoogt de parasympathische zenuwactiviteit. De gevolgen van activering van baroreceptoren zijn dus een verlaging van de hartslag, cardiale output en vasculaire weerstand die samen de stijging van de bloeddruk tegengaan en bufferen³. Daarentegen verhoogt verminderde activiteit van baroreceptorzenuwen de sympathische en vermindert de parasympathische zenuwactiviteit, wat de hartslag, cardiale output en vasculaire weerstand verhoogt en zo de daling van de bloeddruk tegengaat.

Talrijke studies bij mens en dier hebben aangetoond dat de baroreceptorreflex kan worden aangepast onder fysiologische omstandigheden zoals oefening⁴, slaap⁵, hittestress⁶ of zwangerschap⁷. Bovendien zijn er aanwijzingen dat de baroreflex chronisch is aangetast bij hart- en vaatziekten, zoals hypertensie, hartfalen, myocardinfarct en beroerte. In feite wordt baroreflexdisfunctie ook gebruikt als een prognostische marker bij verschillende hart- en vaatziekten ^8,9,10. Verder is disfunctie van de baroreflex ook aanwezig bij aandoeningen van de ANS. Gezien het belang van de baroreceptorreflex voor gezondheids- en ziektetoestanden, is in vivo schatting van deze reflex een belangrijk onderdeel van autonoom en cardiovasculair onderzoek met bepaalde ernstige klinische implicaties.

Genetische muizenlijnen zijn essentiële hulpmiddelen in cardiovasculair onderzoek. In vivo studies van dergelijke muizenlijnen bieden waardevolle inzichten in cardiovasculaire fysiologie en pathofysiologie en dienen in veel gevallen als preklinische modelsystemen voor hart- en vaatziekten. Hier bieden we een protocol voor telemetrische in vivo ECG- en BP-opname in bewuste, ongeremde, vrij bewegende muizen en beschrijven we hoe baroreflexgevoeligheid kan worden bepaald uit deze opnames met behulp van de sequentiemethode (figuur 1B). De toegepaste methode wordt de sequentiemethode genoemd, omdat de beat-to-beat-reeksen van systolische BP (SBP) en RR-intervallen worden gescreend op korte sequenties van drie of meer slagen tijdens spontane toename of afname van SBP met reflexaanpassing van de HR. Deze methode is de gouden standaard voor baroreflex gevoeligheidsbepaling omdat alleen spontane reflexmechanismen worden onderzocht. De techniek is superieur aan oudere technieken die invasieve procedures omvatten, zoals injectie van vasoactieve geneesmiddelen om BP-veranderingen te induceren.

Figuur 1: Schematische weergave van de baroreflex- en baroreflexgevoeligheidsbeoordeling met behulp van de sequentiemethode. (A) Beloop van de baroreflex tijdens een acute verhoging van de bloeddruk. Een kortstondige stijging van ABP wordt waargenomen door baroreceptoren in de aortaboog en de sinus carotis. Deze informatie wordt doorgegeven aan het centrale zenuwstelsel en induceert een afname van de sympathische zenuwactiviteit parallel aan een toename van de parasympathische activiteit. Afgifte van acetylcholine uit zenuwuiteinden in het sinoatriale knooppuntgebied induceert een afname van de tweede boodschapper cAMP in sinoatriale knooppacemakercellen en dus een verlaging van de hartslag. Een kortstondige daling van de bloeddruk heeft het tegenovergestelde effect. (B) Schematische BP-sporen tijdens een opwaartse reeks (paneel linksboven) en omlaag (paneel rechtsboven) van drie opeenvolgende slagen. Een opwaartse reeks is geassocieerd met een parallelle toename van RR-intervallen (linkeronderpaneel), wat overeenkomt met een afname van HR. Een neerwaartse reeks is geassocieerd met een parallelle afname van RR-intervallen (rechterbenedenpaneel), wat overeenkomt met een toename van HR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Voer alle dierstudies uit in overeenstemming met lokale institutionele richtlijnen en nationale wetten inzake dierproeven. Voor dit experiment werden de studies goedgekeurd door de Regierung von Oberbayern en waren ze in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierproeven. WT-dieren (C57BL/6J-achtergrond) en dieren met een muismodel met een ziek sinussyndroom met een verhoogde BRS-gevoeligheid (Hcn4tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (gemengde C57BL/6N en 129/SvJ achtergrond) werden gebruikt voor dit onderzoek. 1. Apparatuur instellen Verwijder een telemetrische zender uit de steriele verpakking en verkort de ECG-kabels tot de lengte die geschikt is voor de grootte van de muis. Voor een 12 weken oude mannelijke zwarte zes muis (C57BL/6J), met een gewicht van ~30 g, verkort u het positieve lood (rood) tot een lengte van ~45 mm en het negatieve lood (kleurloos) tot een lengte van ~40 mm met behulp van een schaar.OPMERKING: Deze waarden worden aangegeven als oriëntatie en moeten zo nodig worden aangepast (figuur 2). Verwijder ongeveer 6 mm van de siliconenslang van het ECG-snoer met behulp van een scalpel om de draad bloot te leggen. Bedek de uiteinden van de draad met overmatige slangen en laat een ~ 2 mm deel van de ECG-draad onbedekt om elektrische signalen op te nemen. Bevestig de siliconenslang met niet-absorbeerbaar 5-0 zijdehechtmateriaal (figuur 2A). Noteer het serienummer van de zender in het bedieningsprotocol (aanvullend bestand 1). Hydrateer de transmitter in warme, steriele 0,9 % NaCl-oplossing. Weeg de muis en noteer het gewicht. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten voorafgaand aan de operatie. Steriliseer ze tijdens de operatie en tussen het opereren van verschillende dieren door droge hitte met behulp van een hete glazen kralensterilisator.OPMERKING: Chirurgische instrumenten moeten voor gebruik afkoelen tot kamertemperatuur om brandwonden op de huid te voorkomen. Desinfecteer de werkbank om aseptische omstandigheden te garanderen. 2. Chirurgische implantatie van telemetrische transmitters voor gecombineerde ECG- en bloeddrukmetingen Dissectie van de linker gemeenschappelijke halsslagader.Verdoof een muis door intraperitoneale injectie van anesthesiemix (100 mg / kg ketamine; 15 mg / kg xylazine; 1 mg / kg acepromazine). Voer een teenknijptest uit om ervoor te zorgen dat de muis volledig wordt verdoofd voordat u met de operatie begint. Gebruik een trimmer om het operatiegebied van onder de kin naar de transversale borstspieren te scheren. Plaats de muis in rugligging op een temperatuurgecontroleerde operatieplaat die is ingesteld op 37 °C. Beveilig de ledematen met chirurgische tape en controleer continu de lichaamstemperatuur met een rectale thermometer (figuur 2C). Als de lichaamstemperatuur onder de 37 °C daalt, bedek dan het lichaam van het dier met steriel katoenen gaas tijdens de operatie. Breng oogzalf aan om de ogen van het dier te beschermen tijdens anesthesie. Breng ontharingscrème aan op het eerder geschoren operatiegebied. Verwijder haar en ontharingscrème met een wattenschijfje en warm water na 3-4 minuten. Zorg ervoor dat de huid schoon is en vrij van achtergebleven haar en ontharingscrème, zodat de wond tijdens de operatie niet besmet raakt. Desinfecteer de huid met verschillende afwisselende rondes povidon-jodium of chloorhexidine scrub gevolgd door alcohol. Plaats het dier onder een ontleedmicroscoop en plaats een steriel gordijn rond het operatiegebied. Maak een 1-1,5 cm middellijnincisie door de huid van de nek, beginnend direct onder de kin. Doe moeite om de incisie zo recht mogelijk te maken. (Figuur 2D).OPMERKING: Tijdens de volgende stappen moet het operatiegebied vochtig worden gehouden door regelmatige toediening van steriele, warme (37 °C) 0,9 % NaCl. Creëer een onderhuidse ruimte aan beide zijden van de incisie door de huid te scheiden van het onderliggende bindweefsel met een stompe dissectieschaar. Zorg ervoor dat u de huid niet te sterk knijpt met de tang, omdat dit necrose kan veroorzaken en kan leiden tot verminderde wondgenezing na de operatie. Scheid de parotis- en submandibulaire klieren met behulp van wattentip-applicators om de musculatuur boven de luchtpijp bloot te leggen. Trek de linker speekselklier in met een gebogen dissectietang om de linker halsslagader te identificeren die zich zijdelings aan de luchtpijp bevindt (figuur 2E). Ontleed voorzichtig de halsslagader van aangrenzend weefsel met behulp van een gebogen tang. Wees heel voorzichtig om de nervus vagus die langs het vat loopt niet te verwonden. Ga door met stompe dissectie om de linker halsslagader bloot te stellen tot ongeveer 10 mm lang en volledig te scheiden van de vasculaire fascia en de nervus vagus (figuur 2F). Passeer een niet-absorbeerbare, 5-0 zijden hechting onder het geïsoleerde deel van de halsslagader terwijl het bloedvat enigszins wordt opgetild met een gebogen tang om de wrijving tussen de hechtdraad en de halsslagader te verminderen, omdat dit de vaatwand gemakkelijk kan beschadigen. Plaats de hechting craniaal, net proximaal aan de bifurcatie van de halsslagader, vorm een knoop en bind deze vast om het vat permanent te laten vallen (figuur 2G). Bevestig beide uiteinden van de hechting van de schedelocclusie aan de operatietafel met chirurgische tape. Passeer een tweede occlusiehechting onder de halsslagader en plaats deze caudaal op ~ 5 mm afstand tot de schedelnaad (figuur 2H). Het is nodig voor tijdelijke occlusie van de bloedstroom tijdens cannulatie van de slagader. Knoop daarom een losse knoop en bevestig beide hechtpunten met chirurgische tape. Plaats een derde hechtdraad (veilige hechting) tussen de schedel- en caudale occlusiehechting en maak een losse knoop (figuur 2I). Deze hechting is nodig om de katheter op zijn plaats te houden tijdens het cannuleren van de slagader. Plak het ene uiteinde van de hechting vast aan de operatietafel. Cannulatie van de linker gemeenschappelijke halsslagader.OPMERKING: Het sensorgebied van de bloeddrukkatheter bevindt zich op 4 mm van het distale uiteinde en bestaat uit een buis met een niet-samendrukbare vloeistof en een biocompatibele gel (figuur 2B). Omdat dit gebied erg gevoelig is, moet u ervoor zorgen dat het vrij is van luchtbellen en het op geen enkel moment tijdens de procedure aanraken.Buig de punt van een naald van 24 G naar een hoek van ~ 100 ° om deze als katheterinbrenger te gebruiken. Trek voorzichtig aan de caudale occlusie-hechting en fixeer deze met spanning om de bloedstroom tijdelijk te stoppen en de slagader enigszins op te tillen. Voorzichtig de slagader proximaal doordringen tot de craniale occlusie-hechting met de gebogen naald (figuur 2J). Pak de katheter vast met een vaatcannulatietang, breng deze in de kleine punctie en laat deze langzaam in het vat glijden. Trek de gebogen naald voorzichtig tegelijkertijd terug (figuur 2K). Wanneer de katheter de caudale occlusiehechting bereikt, spant u de veilige hechtdraad iets aan om de katheter op zijn plaats te houden (figuur 2L). Maak de caudale occlusiehechting los, zodat de katheter verder kan worden verplaatst totdat de punt in de aortaboog is geplaatst.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de juiste inbrenglengte van de katheter bepaalt, omdat dit afhankelijk is van de grootte van de muis. Voor mannelijke muizen met een C57BL/6J-achtergrond op een leeftijd van 12 weken en ~30 g lichaamsgewicht, raden we aan de katheter in te brengen totdat de geïntegreerde inkeping de hechting van de schedelocclusie bereikt. De juiste inbrengdiepte en plaatsing van de katheter voor de specifieke muizenlijn kan worden geverifieerd na euthanasie van het dier. Eenmaal goed geplaatst, zet u de katheter vast met alle drie de hechtingen en snijdt u de uiteinden zo kort mogelijk. Trek de knopen niet te strak, want dit kan de fragiele bloeddrukkatheter beschadigen. Figuur 2: Implantatie van een gecombineerd ECG en bloeddruktransmitter – cannulatie van de linker halsslagader . (A) De telemetriezender bestaat uit een drukkatheter, twee biopotentiële elektroden en het lichaam van het apparaat. (B) Schematische weergave van de drukkatheter. Het sensorgebied bestaat uit een niet-samendrukbare vloeistof en een biocompatibele gel. De katheter moet in de halsslagader worden ingebracht totdat de inkeping zich ter hoogte van de hechting aan de schedelocclusie bevindt om de juiste positie in het bloedvat te garanderen. (C) Verdoofde C57BL/6J-muis voorbereid voor chirurgische implantatie van de borstband. (D-L) Beeldsequentie met chirurgische procedure voor cannulatie van de linker halsslagader. (D) Cervicale huidincisie. (E) Blootgestelde luchtpijp om de linker halsslagader te identificeren die zich zijdelings aan de luchtpijp bevindt. (F) Stompe dissectie om de slagader te isoleren van aangrenzend weefsel en de nervus vagus. (G) Permanente ligatie van de linker halsslagader met craniale occlusiehechting. (H) Spanning toegepast op caudale occlusie-hechting om de bloedstroom tijdelijk te stoppen. (I) Veilige hechting om de katheter op zijn plaats te houden tijdens de cannulatie. (J) Canule met gebogen punt voor het inbrengen van de katheter in het bloedvat. (K) Drukkatheter wordt ingebracht in de halsslagader. (L) De katheterpunt bevindt zich in de aortaboog en de katheter wordt vastgezet met de middelste hechting. Schaalbalk in D – L toont 4 mm. Herdrukt van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Plaatsing van de behuizing van het telemetrieapparaat in een onderhuidse zak op de linkerflank van de muis (figuur 3).Vorm een onderhuidse tunnel vanuit de nek gericht naar de linkerflank van het dier en vorm een klein zakje met behulp van een kleine, stompe ontleedschaar (figuur 3B). Irrigeer de tunnel met een spuit van 1 ml gevuld met warme, steriele 0,9% NaCl-oplossing en breng ~300 μL van de oplossing in het zakje (figuur 3C). Til de huid voorzichtig op met een stompe tang en breng de behuizing van het zenderapparaat in het zakje (figuur 3D). Wees tijdens deze stap heel voorzichtig om de bloeddrukkatheter niet uit de halsslagader te trekken. Plaatsing van de ECG-kabels in Einthoven II-configuratie.Vorm een dunne tunnel naar de rechter borstspier met een stompe ontleedschaar en plaats het negatieve (kleurloze) lood in de tunnel met behulp van een stompe tang. Bevestig het uiteinde van het lood met een steek aan de borstspier met behulp van 6-0 absorbeerbaar hechtmateriaal (figuur 3E). Vorm een lus in het positieve (rode) lood, plaats de punt in het linker caudale ribgebied en zet de positie vast met een hechtdraad met behulp van 6-0 absorbeerbaar hechtmateriaal.OPMERKING: Het is belangrijk dat beide leads over de hele lengte plat tegen het lichaam liggen om weefselirritatie te voorkomen (figuur 3F). Sluit de huid met enkele knopen met 5-0 niet-absorbeerbaar hechtmateriaal (figuur 3H). Breng bovendien een kleine hoeveelheid weefsellijm aan op elke knoop om te voorkomen dat het dier de hechting bijt en dehiscentie te voorkomen. Breng povidon-jodium hydrogel 10% aan op de wond om wondinfectie tijdens de herstelfase te voorkomen. Injecteer voor preventieve pijnverlichting 5 mg/kg carprofen in 0,9% NaCl subcutaan terwijl de muis nog onder narcose is. Stel een verwarmingsplatform in op 39 ± 1 °C en plaats de muis in een aparte behuizingskooi. Plaats de ene helft van de kooi op het platform gedurende 12 uur na de operatie en breng de muis over in de warme ruimte. Wanneer het dier ontwaakt uit de anesthesie, heeft het de mogelijkheid om in het warme gebied te blijven of naar het koelere deel van de kooi te gaan. Figuur 3: Implantatie van een gecombineerd ECG en bloeddruktransmitter – subcutane plaatsing van de ECG-elektroden en het lichaam van het apparaat . (A) Muis na het inbrengen van de bloeddrukkatheter. De positie van de katheter wordt beveiligd door de occlusie-hechtingen. (B) Het vormen van een onderhuidse zak op de linkerflank van het dier met een stompe schaar. (C) Het zakje wordt geïrrigeerd met ~300 μL warme steriele zoutoplossing. (D) Het lichaam van het apparaat wordt in de onderhuidse zak geplaatst. (E) Het uiteinde van de negatieve elektrode (kleurloos) is bevestigd aan de rechter borstspier met absorbeerbaar hechtmateriaal. (F) Fixatie van de positieve elektrode (rood) naar de linker intercostale spieren. (G) Plaatsing van een permanente hechting op de borstspier om de positie van de ECG-elektroden vast te zetten. (H) Muis na sluiting van de huid. De onderhuidse posities van de ECG-elektrodepunten worden aangegeven met rode cirkels. Voor demonstratiedoeleinden werd een dood dier gebruikt om deze foto’s te maken. Volg steriele praktijken tijdens het gebruik van een levend dier. Herdrukt van16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Postoperatieve zorgVoor postoperatieve pijnverlichting injecteert u 5 mg/kg carprofen in 0,9% NaCl subcutaan elke 12 uur gedurende 3-5 dagen totdat de wond is genezen. Injecteer 10 μL/g warme ringer-lactaatoplossing intraperitoneaal om het dier te beschermen tegen uitdroging. Laat de muis 2-3 weken herstellen voordat u de eerste telemetrische metingen uitvoert. Controleer zorgvuldig de algemene gezondheidstoestand, wondgenezing, lichaamsgewicht en voedsel- en waterinname tijdens de herstelperiode. Aan het einde van het experiment, euthanaseer de muis door koolstofdioxide (CO2) inademing.OPMERKING: Cervicale dislocatie of onthoofding wordt niet aanbevolen als euthanasiemethode, omdat dit delen van het ECG- en BP-zenderapparaat kan beschadigen. Data-acquisitie.Neem maatregelen om akoestische en elektronische ruis tijdens de gegevensregistratie te voorkomen. Beperk bovendien de toegang van personeel tijdens de gegevensregistratie en voltooi alle houderijprocedures voorafgaand aan het experiment. Plaats de kooi van het dier op de telemetrie-ontvangerplaat en schakel de telemetrische zender in door een magneet dicht bij het dier te brengen. Verkrijg continue ECG-, bloeddruk- en activiteitsregistraties gedurende 72 uur (12-uurs donker-/lichtcyclus) met data-acquisitiesoftware (figuur 4). Analyse van het circadiane ritme van hartslag, bloeddruk en activiteit.Controleer de aanwezigheid van een regelmatig circadiaans ritme van HR, BP en activiteit met behulp van data-acquisitiesoftware12 (figuur 5). Data-analyse inclusief bepaling van baroreceptorgevoeligheid met behulp van de sequentiemethode met ECG- en BP-analysesoftware.Exporteer BP- en HR-gegevens van data-acquisitiesoftware naar ECG- en BP-analysesoftware (aanvullend bestand 2). Gebruik de volgende reeks opdrachten: Open ECG- en BP-analysesoftware > File > Raw-gegevens van converter > Niet-IOX RAW-gegevens converteren. Klik in het nieuwe venster op Bestand > Dataquest ART4-gegevens laden. Nogmaals, er wordt een nieuw venster geopend, selecteer het gegevensbestand voor export > Nieuw venster wordt geopend, selecteer dier uit de lijst “onderwerpen” en selecteer ECG en BP in de “golfvormenlijst” en druk op OK. Kies dieren van waaruit gegevens moeten worden geconverteerd door te klikken op Gegevens converteren > binair IOX-sitebestand maken. Open het binaire IOX-sitebestand in ECG- en BP-analysesoftware met behulp van de volgende reeks opdrachten: Bestand > IOX-gegevens laden > Selecteer BP- en ECG-tracering > druk op het groene vinkje.OPMERKING: De volgende gegevensverwerkingsparameters zijn geoptimaliseerd voor gegevens die zijn verkregen van wildtypemuizen en moeten in principe passen bij alle muismodellen die in preklinisch veld worden gebruikt. Aanpassing van deze parameters kan echter nodig zijn bij het werken met specifieke experimentele modellen, bijvoorbeeld muizen met extreem hoge of lage HR- en/of BP-waarden of verschillende knaagdiersoorten. In ieder geval moeten de parameters voor gegevensverwerking zorgvuldig worden beoordeeld om ervoor te zorgen dat ze passen in het specifieke model dat wordt bestudeerd. Voor instellingen voor ECG, BP en BRS analyse zie Aanvullend Dossier 3,4. Voor BRS-analyse bij muizen past u de BRS-parameters aan om alleen sequenties van drie (of meer) slagen te detecteren die een vertraging vertonen tussen SBP en RR van één slag, en stelt u de drempel voor SBP- en RR-verandering in op 0,5 mmHg en 2 ms. Zorg ervoor dat de correlatiecoëfficiënt van de helling van de regressielijn van RR/SBP-plots groter is dan 0,75 en analyseer alleen secties met een stabiel sinusritme. Stel de parameters voor ECG-, BP- en BRS-analyse dienovereenkomstig in met behulp van de volgende reeks opdrachten: Instellingen voor > analyse afstemmen > nieuw venster wordt geopendECG-instellingen (klik met de rechtermuisknop in het venster “ECG-modus en signaalfiltering” (aanvullend bestand 3)). Stel de parameters in zoals hier beschreven. Modus: ECG, RR-only, Filtermodus: automatisch, volgens ingestelde HR, Verwachte hartslag: bpm > 300, Baseline removal filter width (ms): 100.00, Noise removal filter width: 1.00 ms, Notch filter: 50.0 Hz, Spike removal filter: off, Drop-out detection mode: off, Max RR lengths (ms): 900.00, RR from adjusted R peaks: off, RR_only settings mode: Xsmall: muis, R piekbreedte (ms): 10,00, PR breedte (ms): 20,00, RT breedte (ms): 50,00, Max inter beat artefact (%): 50,00, R naar andere amplitudeverhouding: 3,00, R piekteken: positief, en Compute extra parameter: uit Voor de bloeddrukinstellingen (BP, Drukinstellingen) klikt u met de rechtermuisknop op het venster “BP-analyzer” (Aanvullend bestand 4). Stel de parameters in zoals hier beschreven. Ruisverwijderingsfilterbreedte (ms): 10,00, Afgeleide filterbreedte (ms): 6,00, Notch-filter: 50,0 Hz, Spike-verwijderingsfilter: uit, Validatiedrempel (cal. unit): 12,00, Afkeurdrempel (cal. unit): 8,00, Afgeleide bij begin upstroke (cal U/s): 10,00, Afkeurlimieten: uit, Vertraging van referentie-ecg: door de gebruiker gedefinieerd venster, Min. vertraging van ecg Rpeak (ms): 10,00, Max vertraging van ecg Rpeak (ms): 250,00, Conduct_time_1 van merk: niet berekend, Conduct_time_2 van merk: niet berekend, BR (ademhalingsfrequentie): uit, BRS (Baroreflexgevoeligheid): aan, Minimaal opeenvolgend slaggetal: 3, Latency beatgetal: 1, Drukwaarde: SBP, Mark-to-compute pulsinterval: R, Minimale drukvariatie (caIU): 0,50, Minimale intervalvariatie (ms): 2,00, Minimale correlatie: 0,75 Screen het activiteitssignaal voor een reeks van 3 uur met lage activiteit. Voer de BRS-analyse uit in dit tijdvenster, omdat hoge activiteit van de dieren de BP- en RR-correlatie verstoort. Voer een BP- en RR-analyse uit tijdens dit tijdvenster van 3 uur terwijl u de 3-uursanalyse opdeelt in stappen van 10 minuten. Voer BRS-analyse uit met behulp van de volgende reeks opdrachten: Open het venster BRS-analyse > > BRS-analyse weergeven. Hiermee wordt het deelvenster BRS-analyse geopend. Inspecteer handmatig elke reeks die wordt weergegeven in het BRS-analysepaneel en sluit ectopische beats, sinuspauzes, aritmische gebeurtenissen of luidruchtige gegevens uit. Zorg ervoor dat u elke beat van dergelijke sequenties ongeldig maakt om ze met succes uit te sluiten van de analyse. Exporteer de resultaten van de BRS-analyse naar een spreadsheetbestand (resultatenbestand). Wijzig de parameters die naar het spreadsheetbestand worden geëxporteerd met behulp van de volgende reeks opdrachten (Aanvullende bestanden 5-7):Stem > parameters af in de lijst / naar het bestand > secties > txt (aanvullend bestand 5). Selecteer het gedeelte “beats” en alle andere secties die interessante informatie bevatten, behalve de sectie ongeldige beats. Stem > parameters af in de lijst / naar het bestand > stappen > txt (aanvullend bestand 6). Kies de stapwaarden die u wilt exporteren. Stem > parameters af in de lijst / naar bestand > verslaat -> txt (aanvullend bestand 7). Zorg ervoor dat het beats-gedeelte van het bestand ten minste de volgende gegevens voor elke afzonderlijke beat bevat. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=opeenvolgende beatintervallen van de reeks), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR van de volgende beat) Klik vervolgens op Bestand > Resultatenbestand opslaan. Sorteer de geëxporteerde gegevens voor op- en neergaande reeksen met behulp van de filterfunctie van Excel (aanvullend bestand 8). Bereken het aantal sequenties, de gemiddelde BRS-helling, de standaardafwijking en de standaardfout van de BRS-helling voor op- en neergaande reeksen afzonderlijk. Bereken ook het totale aantal sequenties per 1000 slagen.OPMERKING: Een spreadsheetsjabloon (TemplateBRS) voor geautomatiseerde sortering en analyse van op- en neergaande sequenties wordt verstrekt in het Supplement (Aanvullend bestand 8) en vergemakkelijkt de analyse. Door de filterfunctie aan te passen, kunt u reeksen sorteren op verschillende beatnummers (bijvoorbeeld reeksen met drie of vier slagen). Voor meer details zie Aanvullende bestanden 9-13.Open het resultatenbestand en het TemplateBRS Excel-bestand (aanvullend bestand 8). Kopieer de gegevens van de volgende kolommen uit het resultatenbestand: (Druk)_BRS_deltaP, (Druk)_BRS_# en (Druk)_BRS_slope (Aanvullend bestand 9). Plak de gegevens in de respectievelijke kolommen van de spreadsheets “Up sequences” en “Down sequences” in het TemplateBRS-bestand (Supplemental File 10). Kopieer bovendien de gegevens van de kolom (Druk)_BRS_SBP uit het resultatenbestand (aanvullend bestand 11) en plak deze in de spreadsheet “Alle reeksen” in het TemplateBRS-bestand (aanvullend bestand 12).OPMERKING: Het getal in de kolom (Druk)_BRS_# wordt alleen weergegeven op het laatste ritme van een reeks en geeft de lengte van de reeks weer. Op- en neergaande reeksen kunnen worden onderscheiden door het teken van de (Druk)_deltaP waarde. Negatieve waarden voor de tweede en derde tel van een reeks van drie slagen geven een neerwaartse reeks aan. Positieve waarden geven respectievelijk een opwaartse volgorde aan. Filter de gekopieerde gegevens met de standaardfilterinstellingen. Klik op het filterpictogram van de kolom (Pressure)_BRS_# en druk op “ok” (Supplemental File 13). Pas deze stap toe op de spreadsheets ‘Up sequences’ en ‘Down sequences’.OPMERKING: De spreadsheetfilters voor reeksen met drie slagen. Als andere volgordelengtes worden aangevraagd, moet de instelling van deze kolom worden gewijzigd in het vervolgkeuzemenu. Berekeningen voor het aantal reeksen, de gemiddelde BRS-helling, de standaardafwijking en de standaardfout van de BRS-helling worden weergegeven in de groene vakken van de spreadsheets “Up sequences” en “Down sequences”. Berekeningen voor het totale aantal reeksen per 1000 slagen worden weergegeven in het groene vak van de spreadsheet ‘Alle reeksen’.

Representative Results

Positieve resultaten voor ECG en BP ruwe dataMet behulp van dit protocol kunnen hoogwaardige ECG- en BP-gegevens worden verkregen (figuur 4 en aanvullend bestand 14), waardoor niet alleen een nauwkeurige BRS-analyse mogelijk is, maar ook een breed scala aan ECG- of BP-afgeleide parameters, bijvoorbeeld ECG-intervallen (figuur 4B, bovenpaneel), bloeddrukparameters (figuur 4B, onderste paneel), hartslag- en bloeddrukvariabiliteit, Aritmie detectie etc12,13,14,15. Figuur 4: Telemetrische ECG – en BP-opnamen. (A) Representatief ECG-spoor van hoge kwaliteit (bovenpaneel) en overeenkomstige ruwe BP-opnamen van hoge kwaliteit (onderpaneel). (B) Vergroting van ECG-sporen (bovenpaneel). P-golf, QRS-complex, T-golf en RR-interval zijn aangegeven. Vergroting van overeenkomstige BP-gegevens (onderste paneel). Diastolische BP (DBP) en systolische BP (SBP) zijn geïndiceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Positieve resultaten voor circadiaans ritmeEen gezonde muis die voldoende hersteld is van een operatie vertoont een fysiologische toename van activiteit, HR en BP tijdens de activiteit (donkere) fase (figuur 5). Veel verschillende factoren kunnen dit regelmatige circadiane ritme verstoren. Deze omvatten psychologische stress, akoestische of elektrische ruis en pijn. Een acute pijnaandoening onmiddellijk na de operatie zou bijvoorbeeld resulteren in een toename van de hartslag met een gelijktijdige afname van de activiteit. Daarom is het circadiane ritme een belangrijke indicator voor de gezondheid en het welzijn van dieren en moet het routinematig worden gecontroleerd vóór BRS-analyse. Figuur 5: Analyse van telemetriemetingen op lange termijn om circadiane ritmevariaties te bepalen. Circadiaans ritme van hartslag (A), activiteit (B), systolische bloeddruk (C) en diastolische bloeddruk (D) gemiddeld van 9 mannelijke wild-type C57BL / 6J muizen gedurende 12 uur lichte en donkere cycli. Grijze gebieden geven de activiteit (donkere) fase weer en witte vlakken geven de rustfase (lichte) fase van de dieren weer. Alle parameters zijn fysiologisch verhoogd tijdens de activiteitsfase (donkere) fase van het dier. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde +/- SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Positieve resultaten voor BRS-analyseNa het uitvoeren van de analyse zoals beschreven in het protocol paragraaf 2.8 zal de software respectievelijk op- en neergaande sequenties detecteren. De gebruikte methode wordt sequentiemethode genoemd, omdat veranderingen in SBP- en RR-intervallen worden onderzocht op een beat-to-beat-basis tijdens korte sequenties van drie of meer slagen met een spontane stijging of daling in SBP (figuur 6). Een continue verhoging van SBP over drie hartslagen veroorzaakt een reflextoename in parasympathische activiteit en vertraagt bijgevolg HR, wat overeenkomt met langere RR-intervallen. De latentie voor de reflex HR-aanpassing is één tel. Een dergelijke reeks is weergegeven in figuur 6A en wordt gedefinieerd als een opwaartse reeks. Daarentegen wordt een continue afname van SBP over drie slagen met parallelle stijging van HR (afname van het RR-interval) gedefinieerd als een neerwaartse reeks (figuur 6B). Om de correlatie tussen RR en SBP te evalueren, worden beide parameters tegen elkaar uitgezet en wordt de helling (ms/mmHg) van de lineaire regressielijn voor elke reeks berekend (figuur 6A,B, onderste panelen). Na sortering op op- en neergaande sequenties kan het gemiddelde aantal sequenties per 1000 slagen (figuur 6C) en de gemiddelde winst van spontane BRS worden berekend voor respectievelijk op- en neergaande sequenties (figuur 6D,E). De winst van spontane BRS wordt weerspiegeld door de helling van de lineaire regressielijn berekend vanuit de RR/SBP-relatie. De afwijking van normale BRS-waarden kan verschillende oorzaken hebben. Deze omvatten veranderingen in ANS-invoer of veranderingen in de responsiviteit van de sinoatriale knoop op input van het autonome zenuwstelsel. In figuur 6 wordt een verhoogde BRS getoond in een muismodel voor sick sinus syndrome (SSS) met overdreven responsiviteit van de sinoatriale knoop op vagale input11. Figuur 6: Schatting van BRS met behulp van de sequentiemethode. (A) Representatief BP-spoor van een wild-type C57BL/6J-muis gedurende een opwaartse reeks van drie opeenvolgende slagen (bovenpaneel) geassocieerd met een parallelle toename van het RR-interval (middenpaneel) wat overeenkomt met een afname van de HR. De RR-intervallen werden uitgezet tegen de SBP (onderste paneel). De helling van de regressielijn (rode lijn) voor de opwaartse reeks afgebeeld in het bovenste en middelste paneel (WT, zwarte cirkels) was 4,10 ms/mmHg. Een representatieve RR/SBP-relatie van het muismodel met sick sinus syndrome leverde een verhoogde helling op van 6,49 ms/mmHg, wat wijst op verhoogde BRS (SSS, grijze cirkels). (B) Representatieve neerwaartse volgorde van een wild-type muis met een daling van SBP (bovenste paneel) en een daaropvolgende afname van het RR-interval (middenpaneel) wat resulteert in een BRS-helling van 4,51 ms/mmHg (onderste paneel; WT, zwarte cirkels). Een representatieve RR/SBP relatie van het sick sinus syndrome muismodel (SSS, grijze cirkels) met een helling van 7,10 ms/mmHg. De oriëntatie van de rode pijlpunten geeft de richting van de reeksen aan (omhoog of omlaag). (C) Totaal aantal sequenties per 1000 slagen voor WT- en SSS-muizen. (D) Gemiddelde helling van de RR/SBP-relatie voor up-sequenties voor WT- en SSS-muizen. (E) Gemiddelde helling van de RR/SBP-relatie voor downsequenties voor WT- en SSS-muizen. Statistieken in (C-E) werden uitgevoerd op basis van resultaten van zes mannelijke WT-dieren en acht mannelijke dieren van het muismodel met het sick sinus syndrome. Boxplots tonen de mediaanlijn, perc 25/75 en min/max waarde; Open symbolen vertegenwoordigen de gemiddelde waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Negatief resultaat voor ruwe datakwaliteitVooral tijdens fasen van hogere activiteit kan de signaalkwaliteit afnemen (figuur 7 en aanvullende bestanden 15,16). Dit kan worden veroorzaakt door tijdelijke verplaatsing of onjuiste positie van de BP-katheter of ECG-kabels of beide als gevolg van beweging van het dier. Ook kan skeletspieractiviteit worden gedetecteerd van de ECG-kabels en ruis veroorzaken (figuur 7B, bovenste paneel). Met de hierboven beschreven software-instellingen worden deze beats van lage kwaliteit niet gedetecteerd en daarom uitgesloten van analyse. Niettemin is handmatige inspectie van de geanalyseerde ruwe gegevens verplicht. Figuur 7: Voorbeelden van ruwe signalen van lage kwaliteit. (A) ECG-signaal (bovenste paneel) wordt gedetecteerd met goede kwaliteit, maar BP-signaal (onderste paneel) kwaliteit is laag. (B) Kwaliteiten van ECG (bovenste paneel) en BP (onderste paneel) signaal zijn niet voldoende. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Negatieve resultaten voor BRS-analyseDe BRS-analyse-instellingen die worden vermeld in protocolparagraaf 2.8.3 zijn over het algemeen essentieel voor een snelle en correcte detectie van op- en neergaande sequenties. De minimale correlatiecoëfficiënt voor de regressielijn is ingesteld op 0,75. Het instellen van te lage waarden voor de minimale correlatiecoëfficiënt resulteert in valse detecties van sequenties die geen baroreflexactiviteit weerspiegelen, maar eerder het gevolg zijn van aritmische slagen (figuur 8). Voor BRS-analyse moeten alleen episodes met een stabiel sinusritme worden geanalyseerd. Ectopische beats of andere aritmische gebeurtenissen, bijvoorbeeld sinuspauzes, kunnen worden gevonden met de HRV-optie van ECG- en BP-analysesoftware en moeten ongeldig worden gemaakt. Figuur 8: Sequenties die geen baroreflexactiviteit weerspiegelen . (A) ECG-spoor van een muis met milde sinusritmestoornissen. (B) BP-opname die een spontane toename van SBP laat zien. (C) Overeenkomstige RR-intervallen duiden op een afname van HR bij de toename van BP. (D) Plot van SBP en overeenkomstige RR-intervallen. De lage correlatiecoëfficiënt van de regressielijn geeft aan dat HR-reductie niet werd veroorzaakt door activiteit van de baroreflex, maar eerder door sinusritmestoornissen. (E) Ruw ECG-spoor dat een sinuspauze weergeeft. (F) Overeenkomstig ruw BP-signaal. De sinuspauze veroorzaakt een daling van de diastolische bloeddruk. De systolische bloeddruk van de daaropvolgende slag is bijna onaangetast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Aanvullend dossier 1: Operatieprotocol. Sjabloon voor documentatie van de chirurgische procedure en postoperatieve zorg. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 2: Dataquest A.R.T-gegevens converteren naar IOX-gegevens voor analyse in ecgAUTO-software. Selecteer dieren in de lijst met onderwerpen (links) en druk en ECG in de lijst met golfvormen (rechts). Druk op OK om gegevens te converteren. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend dossier 3: ECG-instellingen voor BRS-analyse. Stel de parameters in zoals vermeld, druk op OK en pas de configuratie toe. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 4: BP-instellingen voor BRS-analyse. Stel de parameters in zoals vermeld, druk op OK en pas de configuratie toe. Sla de configuratie op als een configuratiebestand om de instellingen gemakkelijk te kunnen laden. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 5: Parameters in lijst / naar bestandsvenster voor “secties”. Kies secties die moeten worden geëxporteerd onder de secties > txt-koptekst (geselecteerd) en druk op Toepassen!. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 6: Parameters in lijst/bestand venster voor “stappen”. Kies de stapgegevens die u wilt exporteren onder de stappen > txt-header (geselecteerd) en druk op Toepassen!. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 7: Parameters in lijst / naar bestandsvenster voor “beats”. Kies waarden die moeten worden geëxporteerd onder de beats > txt-header (geselecteerd) en druk op Toepassen!. Voor BRS-analyse zijn de aangevinkte parameters noodzakelijk. Noteer de volgorde van selectie die door de nummers wordt aangegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 8: TemplateBRS-spreadsheetbestand. Spreadsheetsjabloon voor geautomatiseerde sortering en analyse van op- en neergaande reeksen. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 9: Kopiëren van relevante gegevens uit het resultatenbestand I. Kopieer de kolommen (Druk)_BRS_deltaP, (Druk)_BRS_# en (Druk)_BRS_slope uit het resultatenbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 10: Spreadsheetsjabloonbestand (TemplateBRS) voor gegevenssortering en -analyse I. Plak de gekopieerde gegevens in de respectievelijke kolommen van de spreadsheet “Up sequences” en “Down sequences” in het TemplateBRS-spreadsheetbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 11: Kopiëren van relevante gegevens uit het resultatenbestand II. Kopieer de kolom (Druk)_BRS_SBP uit het resultatenbestand. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 12: Een spreadsheetsjabloonbestand (TemplateBRS) voor het sorteren en analyseren van gegevens II. Plak de gekopieerde SBP-gegevens in de spreadsheet ‘Alle reeksen’ in het TemplateBRS-spreadsheetbestand om het totale aantal reeksen te berekenen. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 13: Filteren en analyseren van de sequenties. Open in de spreadsheet “Up sequences” van het TemplateBRS-spreadsheetbestand het vervolgkeuzemenu van het kolomfilter (Pressure)_BRS_# en druk op OK zonder parameters te wijzigen. Hiermee worden de gegevens automatisch gesorteerd en worden de berekeningen voor reeksen met 3 slagen bijgewerkt. Herhaal dit voor de spreadsheet ‘Downreeksen’. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 14: Screenshot van een opname van hoge kwaliteit gedetecteerd met ECG- en BP-analysesoftware. Het bovenste spoor (ECG) toont de detectie van elke R-piek en het onderste spoor (BP) toont de detectie van elke diastolische druk (DP) en systolische druk (SP) piek. Gebieden onder succesvol gedetecteerde pieken zijn rood gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 15: Screenshot van een BP-opname van lage kwaliteit waarbij BP-parameters slechts gedeeltelijk worden gedetecteerd. Het bovenste spoor (ECG) toont detectie van elke R-piek, maar het onderste spoor (BP) toont hiaten tussen gedetecteerde BP-pieken. Gedetecteerde pieken van diastolische druk (DP) en systolische druk (SP) worden gemarkeerd met rode gebieden. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 16: Screenshot van een ECG- en BP-opname van lage kwaliteit waarbij ECG- en BP-parameters niet konden worden gedetecteerd. Het bovenste spoor (ECG) toont een gebied (paarse achtergrond) waar ECG-parameters niet konden worden gedetecteerd. BP-detectie (lower trace) mislukte ook vanwege de lage signaalkwaliteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Betekenis van de methode ten opzichte van alternatieve methoden
In dit werk presenteren we een gedetailleerd protocol om spontane BRS te kwantificeren met behulp van de sequentiemethode. Deze aanpak maakt gebruik van spontane BP- en reflex-HR-veranderingen gemeten door ECG- en BP-telemetrie. Het voordeel van deze methode is dat beide parameters kunnen worden vastgelegd in bewuste, vrij bewegende, ongeremde dieren zonder dieren te storen door de kamer binnen te lopen waar de metingen worden uitgevoerd of zelfs door fysieke interactie die nodig is voor injectie van medicijnen. Dit punt is erg belangrijk omdat duidelijk is aangetoond dat dergelijke verstoringen de HR- en BP-opnames ernstig verstoren. De injectie van geneesmiddelen vereist bijvoorbeeld fixatie van de muizen, wat een maximale stressrespons veroorzaakt die de HR verhoogt tot 650-700 bpm. Om deze stressreacties te omzeilen, is BRS eerder bepaald bij verdoofde muizen. Standaard anesthetica die in de diergeneeskunde worden gebruikt, zoals ketamine / xylazine of isofluraan, induceren echter bradycardie en beïnvloeden autonome reflexreacties, waardoor de geldigheid van deze benaderingen en de interpretatie van de resultaten worden beperkt. Om deze beperkingen gedeeltelijk te overwinnen, werden implanteerbare medicijnafgifteapparaten gebruikt, d.w.z. osmotische pompen, die geneesmiddelen in de peritoneale holte kunnen vrijgeven. Met osmotische pompen is het echter niet mogelijk om een bolus van een gedefinieerde dosis geneesmiddel toe te passen die de toepassing van dergelijke apparaten beperkt. Als alternatief, complexe infusiekatheters¹⁷ kan in muizen worden geïmplanteerd om medicijnen toe te dienen. Deze katheters zijn echter moeilijk te hanteren en vereisen chirurgische vaardigheden die vergelijkbaar zijn met die welke vereist zijn voor de implantatie van telemetrische apparaten, terwijl ze minder wetenschappelijke resultaten opleveren in vergelijking met metingen van spontane BRS. Naast de technische problemen in verband met het meten van BRS met behulp van injectie van geneesmiddelen, zijn er enkele beperkingen met betrekking tot de werking van het medicijn op zich. Traditionele benaderingen voor het bepalen van BRS omvatten bolusinjecties van vasoactieve geneesmiddelen. Bolusinjectie van vasoconstrictoren (bijv. Fenylefrine) of vaatverwijders (bijv. Natrium nitroprusside) zijn echter beschouwd als een overmatige en niet-fysiologische stimulus voor reflex HR-aanpassing aan veranderingen in BP¹⁸. Spontane activiteit van de baroreceptorreflex kan ook worden gekwantificeerd met behulp van spectrale methoden. Een van deze methoden beoordeelt BRS in het frequentiedomein door de verhouding te berekenen tussen veranderingen in HR en veranderingen in bloeddruk in een specifieke frequentieband¹⁸^,¹⁹. Andere spectraalmethoden omvatten de bepaling van de overdrachtsfunctie van BP en HR of de kwantificering van de coherentie tussen BP en HR²⁰^,²¹. Deze methoden vereisen ook telemetrische acquisitie van spontane BP- en HR-parameters en hoewel ze geschikt zijn voor de bepaling van spontane BRS, vereisen ze intensieve computationele hulpmiddelen en zijn ze een uitdaging om toe te passen. Bovendien lijden alle spectrale methoden aan de beperking dat niet-stationaire signalen de toepassing van spectrale methoden uitsluiten. Met name spectrale pieken geïnduceerd door ademhalingsritmes kunnen bij menselijke patiënten worden verminderd door de patiënt te vragen te stoppen met ademen, terwijl dit bij muizen duidelijk niet mogelijk is. Daarom is de signaal-ruisverhouding bij muizen vaak vrij laag. Gezien de beperkingen van de hierboven besproken methoden, geven we de voorkeur aan de sequentiemethode voor het bepalen van BRS bij muizen. Een aanzienlijk voordeel van deze methode is het feit dat het een niet-invasieve techniek is die gegevens levert over spontane BRS onder reële omstandigheden²². Een ander belangrijk punt is dat de duur van sequenties geanalyseerd met behulp van de sequentiemethode vrij kort is, met 3-5 slagen. Reflexregulatie van HR door de nervus vagus is zeer snel en ruim binnen het tijdsbestek van deze sequenties. Daarom is de sequentiemethode zeer geschikt om de bijdrage van de nervus vagus aan BRS te evalueren. Daarentegen verloopt de regulatie door het sympathische zenuwstelsel veel langzamer. In feite kan tijdens deze korte sequenties worden aangenomen dat de activiteit van het sympathische zenuwstelsel bijna constant is. Daarom is de methode aangepast om selectief reflexveranderingen van de HR te detecteren die worden aangedreven door activiteit van de nervus vagus.

Interpretatie van BRS-gegevens
Voor de interpretatie van BRS-disfunctie of BRS-gegevens op zich is het belangrijk om rekening te houden met de individuele functionele niveaus die betrokken zijn bij de baroreceptorreflex. Op neuronaal niveau kunnen afferente, centrale of efferente componenten van de reflex worden beïnvloed²³. Op cardiovasculair niveau kan een verminderde of overdreven responsiviteit van de sinoatriale knoop op ANS-input aanwezig zijn ^11,24. Een verandering op elk niveau kan leiden tot veranderingen in de BRS. Om te ontleden of neuronale en/of cardiale mechanismen verantwoordelijk zijn voor waargenomen veranderingen in BRS, kunnen cardiale of neuronspecifieke gendeletie, knock-down of genbewerkingsbenaderingen worden gebruikt.

Kritieke stappen in het protocol
De meest geavanceerde en kritische stap in dit protocol is de voorbereiding en cannulatie van de linker halsslagader (stap 2.3). De spanning van de caudale occlusiehechting moet voldoende hoog zijn om de bloedstroom volledig te stoppen vóór cannulatie. Anders kan zelfs een kleine bloedlekkage tijdens cannulatie het zicht ernstig beperken of zelfs de muis doen doodbloeden. Cannulatie moet bij de eerste poging succesvol zijn. Bij het mislukken van de eerste poging is het echter nog steeds mogelijk om de canule zorgvuldig opnieuw te proberen.

De middellijnincisie en subcutane tunnel van de nek naar de linkerflank (stap 2.3) moeten groot genoeg zijn om de zender gemakkelijk zonder kracht in te brengen, maar moeten ook zo klein mogelijk zijn om de zender op zijn plaats te houden. Anders moet men het op zijn plaats vergrendelen met hechtmateriaal of weefsellijm. Omdat muizen een zeer gevoelige huid hebben, kan necrose van de huid optreden als de tunnel voor de zender te klein is.

Als de ECG-elektroden te lang zijn om in de onderhuidse tunnel te passen (stap 2.4), is het noodzakelijk om een nieuwe punt te vormen door de elektrode tot de juiste lengte in te korten. De elektrode moet over de gehele lengte van het lood plat tegen het lichaam liggen. Te lange elektroden zullen de dieren storen en ze zullen proberen de wond te openen om de zender te verwijderen, wat resulteert in het risico op weefselirritatie en wonddehiscentie. Te korte kabels kunnen natuurlijk niet verlengd worden en het kan zijn dat in dit geval de elektroden niet zo gepositioneerd kunnen worden dat ze overeenkomen met de Einthoven II configuratie. We raden daarom aan om de optimale lengte van de ECG-leads te bepalen op een dode muis van hetzelfde geslacht, gewicht en genetische achtergrond.

Muizen moeten een langere hersteltijd krijgen na implantatie van de zender als ze geen normaal circadiaans ritme hebben en dit is niet het fenotype van de onderzochte muislijn (stap 2.7). Een andere reden voor verstoorde circadiane ritmes kan onvoldoende akoestische isolatie zijn van de dierenfaciliteit of het personeel dat tijdens de meting de kamer binnenkomt.

ECG, BP en BRS data-analyse is eenvoudig (stap 2.8). De meest kritieke stap is om ectopische beats, sinuspauzes, aritmische episodes of secties met signalen van lage kwaliteit uit te sluiten van gegevensanalyse.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting [FE 1929/1-1 en WA 2597/3-1]. Wij danken Sandra Dirschl voor de uitstekende technische ondersteuning en Julia Rilling voor het veterinaire advies.

Materials

Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL	CP-Pharma, Germany	1229	anesthesia
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe	Wolfram Droh GmbH, Germany	9166017V
Bepanthen eye and nose ointment	Bayer AG, Germany
Blunt dissecting scissors	Fine Science Tools GmbH, Germany	14078-10
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL	CP-Pharma, Germany	115	preemptive and post-operative pain relief
Cutasept F skin desinfectant	BODE Chemie GmbH, Germany	9803650
Cotton Tipped Applicator sterile	Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany	09-119-9100
Forceps – Micro-Blunted Tips	Fine Science Tools GmbH, Germany	11253-25
Forceps – straight	Fine Science Tools GmbH, Germany	11008-13
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton	Paul Hartmann AG. Germany	401723
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters	Data Sciences International, United States
Homothermic blanket system with flexible probe	Harvard Apparatus, United States
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools GmbH, Germany	18000-45
Ketamine 10%	Ecuphar GmbH, Germany	799-760	anesthesia
Magnet	Data Sciences International, United States		transmitter turn on/off
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter	Fine Science Tools GmbH, Germany	12502-12
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710005525	24 G needle
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm	Henke-Sass Wolf GmbH, Germany	4710004020	27 G needle
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided)	Resorba Medical, Germany	PA10273	lead fixation
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided)	Resorba Medical, Germany	4023	skin closure
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope	Zeiss, Germany
Pilca depilatory mousse	Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany	6943151
PVP-Iodine hydrogel 10%	Ratiopharm, Germany
Ringer's lactate solution	B. Braun Melsungen AG, Germany	401-951
Sensitive plasters, Leukosilk	BSN medical GmbH, Germany	102100	surgical tape
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml	B. Braun Melsungen AG, Germany
Surgibond tissue adhesive	SMI, Belgium	ZG2
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided)	Resorba Medical, Germany	G2105	lead preparation, ligation sutures
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1	Procter & Gamble
Vessel Cannulation Forceps	Fine Science Tools GmbH, Germany	18403-11
Xylazine (Xylariem) 2%	Ecuphar GmbH, Germany	797469	anesthesia
Data acquisition and analysis	Source
DSI Data Exchange Matrix	Data Sciences International, United States
DSI Dataquest ART 4.33	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI Ponemah	Data Sciences International, United States		data aquisition software
DSI PhysioTel HDX-11 for mice	Data Sciences International, United States
DSI PhysioTel receivers RPC1	Data Sciences International, United States
ecgAUTO v3.3.5.11	EMKA Technologies		ECG and BP analysis software
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, United States

Referências

Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
Heyman, C., Neil, E. Reflexogenic areas of the cardiovascular system. British Journal of Surgery. 46 (195), 92 (1958).
Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, 975-983 (2004).
Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), 1417-1423 (1990).
Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019)
Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Rötzer, R. D., Brox, V. F., Hennis, K., Thalhammer, S. B., Biel, M., Wahl-Schott, C., Fenske, S. Implantation of Combined Telemetric ECG and Blood Pressure Transmitters to Determine Spontaneous Baroreflex Sensitivity in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (168), e62101, doi:10.3791/62101 (2021).