Baroreflex er en hjertefrekvensreguleringsmekanisme av det autonome nervesystemet som respons på blodtrykksendringer. Vi beskriver en kirurgisk teknikk for å implantere telemetritransmittere for kontinuerlig og samtidig måling av elektrokardiogram og blodtrykk hos mus. Dette kan bestemme spontan baroreflex-sensitivitet, en viktig prognostisk markør for hjerte- og karsykdom.
Blodtrykk (BP) og hjertefrekvens (HR) styres begge av det autonome nervesystemet (ANS) og er tett sammenflettet på grunn av refleksmekanismer. Baroreflex er en viktig homeostatisk mekanisme for å motvirke akutte, kortsiktige endringer i arteriell BP og for å opprettholde BP i et relativt smalt fysiologisk område. BP registreres av baroreceptorer lokalisert i aortabuen og carotis sinus. Når BP endres, overføres signaler til sentralnervesystemet og kommuniseres deretter til de parasympatiske og sympatiske grenene i det autonome nervesystemet for å justere HR. En økning i BP forårsaker en refleksreduksjon i HR, en nedgang i BP forårsaker en refleksøkning i HR.
Baroreflex-følsomhet (BRS) er det kvantitative forholdet mellom endringer i arteriell BP og tilsvarende endringer i HR. Kardiovaskulære sykdommer er ofte forbundet med nedsatt baroreflexfunksjon. I ulike studier er redusert BRS rapportert ved f.eks. hjertesvikt, hjerteinfarkt eller koronarsykdom.
Bestemmelse av BRS krever informasjon fra både BP og HR, som kan registreres samtidig ved hjelp av telemetriske enheter. Den kirurgiske prosedyren beskrives som begynner med innsetting av trykksensoren i venstre halspulsåre og plassering av spissen i aortabuen for å overvåke arterielt trykk etterfulgt av subkutan plassering av senderen og EKG-elektrodene. Vi beskriver også postoperativ intensivbehandling og smertestillende behandling. Etter en to-ukers periode med gjenoppretting etter operasjonen, utføres langsiktige EKG- og BP-registreringer i bevisste og uhemmede mus. Til slutt inkluderer vi eksempler på høykvalitetsopptak og analyse av spontan baroreceptorfølsomhet ved hjelp av sekvensmetoden.
Den arterielle baroreceptorrefleksen er det viktigste tilbakemeldingskontrollsystemet hos mennesker som gir en kortsiktig – og muligens også langsiktig 1,2 – kontroll av arterielt blodtrykk (ABP). Denne refleksen bufrer forstyrrelser i BP som oppstår som respons på fysiologiske eller miljømessige utløsere. Det gir raske refleksendringer i hjertefrekvens, slagvolum og total perifer arteriell motstand. Refleksen har sitt utspring i sensoriske nerveender i aortabuen og carotisbihulene. Disse nerveterminalene utgjør arterielle baroreceptorer. Somata av nerveterminaler i aortabuen ligger i nodose ganglion, mens de av nerveterminaler i carotis sinus ligger i petrosal ganglion. Refleksen utløses av økt blodtrykk, som strekker og aktiverer baroreceptornerveterminalene (figur 1A). Aktivering resulterer i aksjonspotensielle volleyer som overføres sentralt via afferente aortadepressor og carotis sinusnerver til kardiovaskulære hjernestammekjerner som nucleus tractus solitarii og den dorsale kjernen i vagalnerven. Endringer i afferente nerveaktivitet modulerer i sin tur den autonome efferente aktiviteten. Økt aktivitet av baroreceptornerver reduserer sympatisk og øker parasympatisk nerveaktivitet. Dermed er konsekvensene av aktivering av baroreceptorer en reduksjon i hjertefrekvens, hjerteutgang og vaskulær motstand som sammen motvirker og bufrer økningen i blodtrykk3. I motsetning til dette øker redusert aktivitet av baroreceptornerver sympatisk og reduserer parasympatisk nerveaktivitet, noe som øker hjertefrekvensen, hjerteutgangen og vaskulær motstand og dermed motvirker reduksjonen i blodtrykket.
Tallrike studier på mennesker og dyr har vist at baroreceptorrefleksen kan justeres under fysiologiske forhold som trening4, søvn5, varmestress6 eller graviditet7. I tillegg er det tegn på at baroreflex er kronisk svekket i kardiovaskulære sykdommer, som hypertensjon, hjertesvikt, hjerteinfarkt og hjerneslag. Faktisk brukes baroreflex dysfunksjon også som en prognostisk markør i flere kardiovaskulære sykdommer 8,9,10. Videre er dysfunksjon av baroreflex også tilstede i lidelser i ANS. Gitt betydningen av baroreceptorrefleksen for helse- og sykdomstilstander, er in vivo-estimering av denne refleksen en viktig komponent i autonom og kardiovaskulær forskning med visse alvorlige kliniske implikasjoner.
Genetiske muselinjer er viktige verktøy i kardiovaskulær forskning. In vivo studier av slike muselinjer gir verdifull innsikt i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi og fungerer i mange tilfeller som prekliniske modellsystemer for hjerte- og karsykdommer. Her gir vi en protokoll for telemetrisk in vivo EKG og BP-registrering i bevisste, uhemmede, fritt bevegelige mus og beskriver hvordan baroreflex-følsomhet kan bestemmes fra disse opptakene ved hjelp av sekvensmetoden (figur 1B). Den anvendte metoden kalles sekvensmetoden, fordi beat-to-beat-serien av systolisk BP (SBP) og RR-intervaller screenes for korte sekvenser på tre eller flere slag under spontan økning eller reduksjon i SBP med reflekstilpasning av HR. Denne metoden er gullstandarden for baroreflex følsomhetsbestemmelse siden bare spontane refleksmekanismer undersøkes. Teknikken er overlegen eldre teknikker som involverte invasive prosedyrer som injeksjon av vasoaktive legemidler for å indusere BP-endringer.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av baroreflex og baroreflex sensitivitetsvurdering ved hjelp av sekvensmetoden . (A) Forløp av baroreflex under en akutt økning i blodtrykket. En kortsiktig økning i ABP registreres av baroreceptorer lokalisert i aortabuen og carotis sinus. Denne informasjonen overføres til sentralnervesystemet og induserer en reduksjon i sympatisk nerveaktivitet parallelt med en økning i parasympatisk aktivitet. Frigjøring av acetylkolin fra nerveender lokalisert i sinoatrialknuteregionen induserer en reduksjon av den andre budbringeren cAMP i pacemakerceller fra sinoatrialknute og dermed en reduksjon i hjertefrekvensen. En kortsiktig reduksjon i blodtrykket har motsatt effekt. (B) Skjematiske BP-spor under en opp-sekvens (øvre venstre panel) og nedsekvens (øvre høyre panel) av tre påfølgende slag. En opp-sekvens er assosiert med en parallell økning i RR-intervaller (nedre venstre panel) som tilsvarer en reduksjon i HR. En nedsekvens er assosiert med en parallell reduksjon i RR-intervaller (nedre høyre panel) som tilsvarer en økning i HR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Metodens betydning med hensyn til alternative metoder
I dette arbeidet presenterer vi en detaljert protokoll for å kvantifisere spontan BRS ved hjelp av sekvensmetoden. Denne tilnærmingen benytter spontane BP- og refleks-HR-endringer målt ved EKG- og BP-telemetri. Fordelen med denne metoden er at begge parametrene kan registreres i bevisste, fritt bevegelige, uhemmede dyr uten å forstyrre dyr ved å gå inn i rommet der målingene utføres eller til og med ved fysisk interaksjon som kreves for injeksjon av legemidler. Dette punktet er svært viktig siden det har blitt tydelig vist at slike forstyrrelser alvorlig forstyrrer HR- og BP-registreringer. For eksempel krever injeksjon av medisiner fiksering av musene, noe som gir en maksimal stressrespons som øker HR opp til 650-700 bpm. For å omgå disse stressresponsene har BRS tidligere blitt bestemt i bedøvede mus. Standard anestetika brukt i veterinærmedisin som ketamin/xylazin eller isofluran induserer imidlertid bradykardi og påvirker autonome refleksresponser, noe som begrenser validiteten av disse tilnærmingene og tolkningen av resultatene. For delvis å overvinne disse begrensningene ble implanterbare legemiddelleveringsenheter, dvs. osmotiske pumper, som kan frigjøre legemidler i bukhulen, brukt. Med osmotiske pumper er det imidlertid ikke mulig å påføre en bolus med en definert dose medikament som begrenser anvendelsen av slike enheter. Alternativt komplekse infusjonskatetre17 kan implanteres i mus for å administrere legemidler. Imidlertid er disse katetrene vanskelige å håndtere og krever kirurgiske ferdigheter som er sammenlignbare med de som kreves for implantasjon av telemetriske enheter, samtidig som de produserer mindre vitenskapelig utfall sammenlignet med målinger av spontan BRS. Ved siden av de tekniske problemene knyttet til måling av BRS ved bruk av injeksjon av legemidler, er det noen begrensninger knyttet til legemiddelvirkningen i seg selv. Tradisjonelle tilnærminger for å bestemme BRS inkluderer bolusinjeksjoner av vasoaktive legemidler. Bolusinjeksjon av vasokonstriktorer (f.eks. fenylefrin) eller vasodilatorer (f.eks. natriumnitroprussid) har imidlertid blitt ansett som en overdreven og ikke-fysiologisk stimulans for refleks HR-tilpasning til endringer i BP18. Baroreceptorrefleksens spontane aktivitet kan også kvantifiseres ved hjelp av spektrale metoder. En av disse metodene vurderer BRS i frekvensdomenet ved beregning av forholdet mellom endringer i HR og endringer i blodtrykk i et bestemt frekvensbånd18,19. Andre spektralmetoder involverer bestemmelse av overføringsfunksjonen til BP og HR eller kvantifisering av sammenhengen mellom BP og HR20,21. Disse metodene krever også telemetrisk oppkjøp av spontane BP- og HR-parametere, og selv om de er hensiktsmessige for bestemmelse av spontan BRS, krever de intensive beregningsverktøy og er utfordrende å anvende. Videre lider alle spektrale metoder av begrensningen at ikke-stasjonære signaler utelukker anvendelsen av spektrale metoder. Spesielt kan spektrale topper indusert av respirasjonsrytmer reduseres hos mennesker ved å be pasienten om å slutte å puste, mens dette åpenbart ikke er mulig hos mus. Derfor er signal-støy-forholdet ofte ganske lavt hos mus. Gitt begrensningene i metodene diskutert ovenfor, favoriserer vi sekvensmetoden for å bestemme BRS hos mus. En betydelig fordel med denne metoden er at det er en ikke-invasiv teknikk som gir data om spontan BRS under virkelige forhold22. Et annet viktig poeng er at varigheten av sekvenser analysert ved hjelp av sekvensmetoden er ganske kort, og involverer 3-5 slag. Refleksregulering av HR av vagalnerven er veldig rask og godt innenfor tidsrammen for disse sekvensene. Derfor er sekvensmetoden godt egnet til å evaluere vagalnervens bidrag til BRS. Derimot er reguleringen av det sympatiske nervesystemet mye langsommere. Faktisk, i løpet av disse korte sekvensene kan aktiviteten til det sympatiske nervesystemet antas å være nesten konstant. Derfor er metoden tilpasset for selektivt å oppdage refleksendringer i HR drevet av vagusnerveaktivitet.
Tolkning av BRS-data
For tolkning av BRS-dysfunksjon eller BRS-data i seg selv er det viktig å vurdere de individuelle funksjonsnivåene som er involvert i baroreceptorrefleksen. På nevronnivå kan afferente, sentrale eller efferente komponenter i refleksen påvirkes23. På kardiovaskulært nivå kan redusert eller overdreven respons fra sinoatrialknuten på ANS-inngang være til stede11,24. En endring på hvert nivå kan føre til endringer i BRS. For å dissekere om nevronale og/eller hjertemekanismer er ansvarlige for observerte endringer i BRS, hjerte- eller nevronspesifikk gendelesjon, kan man bruke nedslags- eller genredigeringsmetoder.
Kritiske trinn i protokollen
Det mest sofistikerte og kritiske trinnet i denne protokollen er forberedelse og kanylering av venstre halspulsåre (trinn 2.3). Spenningen i den kaudale okklusjonsuturen må være tilstrekkelig høy til å stoppe blodstrømmen helt før kanylering. Ellers kan selv en liten lekkasje av blod under kanylering sterkt begrense synligheten eller til og med føre til at musen blør i hjel. Cannulation skal lykkes ved første forsøk. Men ved mislykket første forsøk er det fortsatt mulig å prøve kanylering forsiktig på nytt.
Midtlinjesnittet og den subkutane tunnelen fra halsen til venstre flanke (trinn 2.3) må være stor nok til at senderen enkelt kan settes inn uten kraft, men må også være så liten som mulig for å holde senderen på plass. Ellers må man låse den på plass med suturmateriale eller vevlim. Siden mus har en veldig delikat hud, kan nekrose av huden oppstå hvis tunnelen for senderen er for liten.
Hvis EKG-elektrodene er for lange til å passe inn i den subkutane tunnelen (trinn 2.4), er det nødvendig å danne en ny spiss ved å forkorte elektroden til riktig lengde. Elektroden må ligge flatt mot kroppen over hele ledningens lengde. For lenge vil elektroder forstyrre dyrene, og de vil prøve å åpne såret for å fjerne senderen, noe som resulterer i risiko for vevsirritasjon og sårdehiscens. Ledninger som er for korte kan selvfølgelig ikke forlenges, og det kan være at elektrodene i dette tilfellet ikke kan plasseres på en slik måte at de tilsvarer Einthoven II-konfigurasjonen. Vi anbefaler derfor å bestemme den optimale lengden på EKG-ledningene på en død mus av samme kjønn, vekt og genetisk bakgrunn.
Mus bør gis en lengre restitusjonstid etter transmitterimplantasjon hvis de ikke har en normal døgnrytme og dette ikke er fenotypen til muselinjen som studeres (trinn 2.7). En annen årsak til forstyrret døgnrytme kan være utilstrekkelig akustisk isolasjon av dyreavdelingen eller at personell kommer inn i rommet under målingen.
EKG-, BP- og BRS-dataanalyse er rett frem (trinn 2.8). Det mest kritiske trinnet er å ekskludere ektopiske beats, bihulepauser, arytmiske episoder eller seksjoner med signaler av lav kvalitet fra dataanalyse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den tyske forskningsstiftelsen [FE 1929/1-1 og WA 2597/3-1]. Vi takker Sandra Dirschl for utmerket teknisk assistanse og Julia Rilling for veterinærråd.
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
Forceps – Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
Forceps – straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
Data acquisition and analysis | Source | ||
DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |