Baroreflex er en hjertefrekvensreguleringsmekanisme af det autonome nervesystem som reaktion på blodtryksændringer. Vi beskriver en kirurgisk teknik til implantering af telemetrisendere til kontinuerlig og samtidig måling af elektrokardiogram og blodtryk hos mus. Dette kan bestemme spontan baroreflexfølsomhed, en vigtig prognostisk markør for hjerte-kar-sygdomme.
Blodtryk (BP) og puls (HR) styres begge af det autonome nervesystem (ANS) og er tæt sammenflettet på grund af refleksmekanismer. Baroreflex er en vigtig homeostatisk mekanisme til at modvirke akutte, kortsigtede ændringer i arteriel BP og til at opretholde BP i et relativt snævert fysiologisk område. BP registreres af baroreceptorer placeret i aortabuen og carotis sinus. Når BP ændres, overføres signaler til centralnervesystemet og kommunikeres derefter til de parasympatiske og sympatiske grene af det autonome nervesystem for at justere HR. En stigning i BP forårsager et refleksfald i HR, et fald i BP forårsager en refleksforøgelse i HR.
Baroreflex følsomhed (BRS) er det kvantitative forhold mellem ændringer i arteriel BP og tilsvarende ændringer i HR. Kardiovaskulære sygdomme er ofte forbundet med nedsat baroreflexfunktion. I forskellige undersøgelser er reduceret BRS blevet rapporteret i f.eks. hjertesvigt, myokardieinfarkt eller koronararteriesygdom.
Bestemmelse af BRS kræver information fra både BP og HR, som kan registreres samtidigt ved hjælp af telemetriske enheder. Den kirurgiske procedure beskrives begyndende med indsættelsen af tryksensoren i venstre halspulsåre og placeringen af dens spids i aortabuen for at overvåge arterielt tryk efterfulgt af den subkutane placering af transmitteren og EKG-elektroderne. Vi beskriver også postoperativ intensiv pleje og smertestillende behandling. Efter en to-ugers periode med bedring efter operationen udføres langsigtede EKG- og BP-optagelser i bevidste og uhæmmede mus. Endelig inkluderer vi eksempler på optagelser af høj kvalitet og analyse af spontan baroreceptorfølsomhed ved hjælp af sekvensmetoden.
Den arterielle baroreceptorrefleks er det vigtigste feedback-kontrolsystem hos mennesker, som giver en kortvarig – og muligvis også længerevarende 1,2 – kontrol af arterielt blodtryk (ABP). Denne refleks buffer forstyrrelser i BP, der opstår som reaktion på fysiologiske eller miljømæssige udløsere. Det giver hurtige refleksændringer i hjertefrekvens, slagvolumen og total perifer arteriel modstand. Refleksen stammer fra sensoriske nerveender i aortabuen og carotis bihuler. Disse nerveterminaler udgør de arterielle baroreceptorer. Somata af nerveterminaler i aortabuen er placeret i nodoseganglionen, mens de af nerveterminaler i carotis sinus er placeret i petrosal ganglion. Refleksen udløses af en stigning i blodtrykket, som strækker og aktiverer baroreceptornerveterminalerne (figur 1A). Aktivering resulterer i aktionspotentielle volleys, som overføres centralt via den afferente aortadepressor og carotis sinusnerver til kardiovaskulære hjernestammekerner såsom nucleus tractus solitarii og vagusnervens dorsale kerne. Ændringer i afferente nerveaktivitet modulerer igen den autonome efferente aktivitet. Øget aktivitet af baroreceptornerver nedsætter sympatisk og øger parasympatisk nerveaktivitet. Konsekvenserne af aktivering af baroreceptorer er således en reduktion i hjertefrekvens, hjerteudgang og vaskulær resistens, som tilsammen modvirker og buffer stigningen i blodtrykket3. I modsætning hertil øger nedsat aktivitet af baroreceptornerver sympatisk og nedsætter parasympatisk nerveaktivitet, hvilket øger hjertefrekvens, hjerteudgang og vaskulær modstand og dermed modvirker faldet i blodtrykket.
Talrige undersøgelser hos mennesker og dyr har vist, at baroreceptorrefleksen kan justeres under fysiologiske forhold som motion4, søvn5, varmestress6 eller graviditet7. Derudover er der tegn på, at baroreflex er kronisk nedsat i hjerte-kar-sygdomme, såsom hypertension, hjertesvigt, myokardieinfarkt og slagtilfælde. Faktisk anvendes baroreflexdysfunktion også som en prognostisk markør i flere hjerte-kar-sygdomme 8,9,10. Desuden er dysfunktion af baroreflex også til stede i lidelser i ANS. I betragtning af baroreceptorrefleksens betydning for sundhed og sygdomstilstande er in vivo-estimering af denne refleks en vigtig komponent i autonom og kardiovaskulær forskning med visse alvorlige kliniske implikationer.
Genetiske muselinjer er vigtige værktøjer i kardiovaskulær forskning. In vivo-studier af sådanne muselinjer giver værdifuld indsigt i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi og fungerer i mange tilfælde som prækliniske modelsystemer for hjerte-kar-sygdomme. Her giver vi en protokol for telemetrisk in vivo EKG og BP optagelse i bevidste, uhæmmede, frit bevægelige mus og beskriver, hvordan baroreflexfølsomhed kan bestemmes ud fra disse optagelser ved hjælp af sekvensmetoden (figur 1B). Den anvendte metode kaldes sekvensmetoden, fordi beat-to-beat-serien af systoliske BP- (SBP) og RR-intervaller screenes for korte sekvenser på tre eller flere slag under spontan stigning eller fald i SBP med reflekstilpasning af HR. Denne metode er guldstandarden for bestemmelse af baroreflexfølsomhed, da kun spontane refleksmekanismer undersøges. Teknikken er bedre end ældre teknikker, der involverede invasive procedurer såsom injektion af vasoaktive lægemidler for at fremkalde BP-ændringer.
Figur 1: Skematisk gengivelse af følsomhedsvurderingen af baroreflex og baroreflex ved hjælp af sekvensmetoden . (A) Baroreflexens forløb under en akut stigning i blodtrykket. En kortvarig stigning i ABP registreres af baroreceptorer placeret i aortabuen og carotis sinus. Disse oplysninger overføres til centralnervesystemet og inducerer et fald i sympatisk nerveaktivitet parallelt med en stigning i parasympatisk aktivitet. Frigivelse af acetylcholin fra nerveender placeret i sinoatriale knude region inducerer et fald i den anden messenger cAMP i sinoatriale knude pacemaker celler og dermed en reduktion i hjertefrekvensen. Et kortvarigt fald i blodtrykket har den modsatte virkning. (B) Skematiske BP-spor under en op-sekvens (øverste venstre panel) og nedsekvens (øverste højre panel) af tre på hinanden følgende slag. En op-sekvens er forbundet med en parallel stigning i RR-intervaller (nederste venstre panel), hvilket svarer til et fald i HR. En nedsekvens er forbundet med et parallelt fald i RR-intervaller (nederste højre panel), hvilket svarer til en stigning i HR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Metodens betydning i forhold til alternative metoder
I dette arbejde præsenterer vi en detaljeret protokol til kvantificering af spontan BRS ved hjælp af sekvensmetoden. Denne tilgang anvender spontane BP- og refleks-HR-ændringer målt ved EKG og BP-telemetri. Fordelen ved denne metode er, at begge parametre kan registreres i bevidste, frit bevægelige, uhæmmede dyr uden at forstyrre dyr ved at gå ind i det rum, hvor målingerne udføres eller endda ved fysisk interaktion, der kræves til injektion af lægemidler. Dette punkt er meget vigtigt, da det klart er blevet påvist, at sådanne forstyrrelser alvorligt forstyrrer HR- og BP-optagelser. For eksempel kræver injektion af lægemidler fiksering af musene, hvilket medfører et maksimalt stressrespons, der øger HR op til 650-700 bpm. For at omgå disse stressresponser er BRS tidligere blevet bestemt i bedøvede mus. Imidlertid inducerer standardanæstetika, der anvendes i veterinærmedicin, såsom ketamin/xylazin eller isofluran, bradykardi og påvirker autonome refleksresponser, hvilket begrænser gyldigheden af disse tilgange og fortolkningen af resultaterne. For delvist at overvinde disse begrænsninger blev implanterbare lægemiddelafgivelsesanordninger, dvs. osmotiske pumper, som kan frigive lægemidler i bughulen, brugt. Med osmotiske pumper er det imidlertid ikke muligt at anvende en bolus af en defineret dosis lægemiddel, der begrænser anvendelsen af sådanne anordninger. Alternativt komplekse infusionskatetre17 kan implanteres i mus for at administrere lægemidler. Disse katetre er imidlertid vanskelige at håndtere og kræver kirurgiske færdigheder, der kan sammenlignes med dem, der kræves til implantation af telemetriske enheder, samtidig med at de giver mindre videnskabeligt resultat sammenlignet med målinger af spontan BRS. Ud over de tekniske problemer forbundet med måling af BRS ved hjælp af injektion af lægemidler er der nogle begrænsninger relateret til lægemiddelvirkningen i sig selv. Traditionelle tilgange til bestemmelse af BRS omfatter bolusinjektioner af vasoaktive lægemidler. Imidlertid er bolusinjektion af vasokonstriktorer (f.eks. phenylephrin) eller vasodilatorer (f.eks. natriumnitroprussid) blevet betragtet som en overdreven og ikke-fysiologisk stimulus til refleks HR-tilpasning til ændringer i BP18. Spontan aktivitet af baroreceptorrefleksen kan også kvantificeres ved hjælp af spektrale metoder. En af disse metoder vurderer BRS i frekvensdomænet ved beregning af forholdet mellem ændringer i HR og ændringer i blodtryk i et specifikt frekvensbånd18,19. Andre spektrale metoder involverer bestemmelse af BP’s og HR’s overførselsfunktion eller kvantificering af sammenhængen mellem BP og HR20,21. Disse metoder kræver også telemetrisk erhvervelse af spontane BP- og HR-parametre, og selvom de er egnede til bestemmelse af spontan BRS, kræver de intensive beregningsværktøjer og er udfordrende at anvende. Desuden lider alle spektrale metoder under den begrænsning, at ikke-stationære signaler udelukker anvendelsen af spektrale metoder. Især spektraltoppe induceret af respirationsrytmer kan reduceres hos menneskelige patienter ved at bede patienten om at stoppe med at trække vejret, mens dette naturligvis ikke er muligt hos mus. Derfor er signal-støj-forholdet ofte ret lavt hos mus. I betragtning af begrænsningerne i de ovenfor beskrevne metoder favoriserer vi sekvensmetoden til bestemmelse af BRS hos mus. En betydelig fordel ved denne metode er, at det er en ikke-invasiv teknik, der giver data om spontan BRS under virkelige forhold22. Et yderligere vigtigt punkt er, at varigheden af sekvenser analyseret ved hjælp af sekvensmetoden er ret kort, der involverer 3-5 slag. Refleksregulering af HR ved vagusnerven er meget hurtig og godt inden for tidsrammen for disse sekvenser. Derfor er sekvensmetoden velegnet til at evaluere vagusnervens bidrag til BRS. I modsætning hertil er reguleringen af det sympatiske nervesystem meget langsommere. Faktisk kan aktiviteten i det sympatiske nervesystem under disse korte sekvenser antages at være næsten konstant. Derfor er metoden tilpasset til selektivt at detektere refleksændringer i HR drevet af vagusnerveaktivitet.
Fortolkning af BRS-data
Til fortolkning af BRS-dysfunktion eller BRS-data i sig selv er det vigtigt at overveje de individuelle funktionelle niveauer, der er involveret i baroreceptorrefleksen. På neuronalt niveau kan afferente, centrale eller efferente komponenter i refleksen blive påvirket23. På det kardiovaskulære niveau kan nedsat eller overdreven respons af sinoatriale knude til ANS-input være til stede11,24. En ændring på hvert niveau kan føre til ændringer i BRS. For at dissekere, om neuronale og / eller hjertemekanismer er ansvarlige for observerede ændringer i BRS, hjerte- eller neuronspecifik gensletning, knock down eller genredigeringsmetoder kunne anvendes.
Kritiske trin i protokollen
Det mest sofistikerede og kritiske trin i denne protokol er forberedelsen og kanyleringen af venstre halspulsåre (trin 2.3). Spændingen af den kaudale okklusionssutur skal være tilstrækkelig høj til helt at stoppe blodgennemstrømningen før kanylering. Ellers kan selv en lille lækage af blod under kanylering alvorligt begrænse synligheden eller endda få musen til at bløde ihjel. Kanylering skal lykkes ved første forsøg. Men ved manglende første forsøg er det stadig muligt at omhyggeligt prøve kanylering igen.
Midterlinjesnittet og den subkutane tunnel fra halsen til venstre flanke (trin 2.3) skal være stor nok til let at indføre senderen uden kraft, men skal også være så lille som muligt for at holde senderen på plads. Ellers bliver man nødt til at låse den på plads med suturmateriale eller vævslim. Da mus har en meget delikat hud, kan nekrose af huden forekomme, hvis tunnelen til senderen er for lille.
Hvis EKG-elektroderne er for lange til at passe ind i den subkutane tunnel (trin 2.4), er det nødvendigt at danne en ny spids ved at forkorte elektroden til en passende længde. Elektroden skal ligge fladt mod kroppen over hele blyets længde. For lange elektroder vil forstyrre dyrene, og de vil forsøge at åbne såret for at fjerne senderen, hvilket resulterer i risiko for vævsirritation og sårdehiscens. Ledninger, der er for korte, kan naturligvis ikke forlænges, og det kan være, at elektroderne i dette tilfælde ikke kan placeres på en sådan måde, at de svarer til Einthoven II-konfiguration. Vi anbefaler derfor at bestemme den optimale længde af EKG-ledningerne på en død mus af samme køn, vægt og genetiske baggrund.
Mus bør have en længere restitutionstid efter implantation af senderen, hvis de ikke har en normal døgnrytme, og dette ikke er fænotypen for den undersøgte muselinje (trin 2.7). En anden årsag til forstyrret døgnrytme kan være utilstrækkelig akustisk isolering af dyreanlægget eller personale, der kommer ind i rummet under målingen.
EKG-, BP- og BRS-dataanalyse er ligetil (trin 2.8). Det mest kritiske trin er at udelukke ektopiske beats, sinuspauser, arytmiske episoder eller sektioner med signaler af lav kvalitet fra dataanalyse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsfond [FE 1929/1-1 og WA 2597/3-1]. Vi takker Sandra Dirschl for fremragende teknisk assistance og Julia Rilling for veterinærrådgivning.
Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
Forceps – Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
Forceps – straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
Gauze swabs with cut edges, 7.5×7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
HD‑X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
Data acquisition and analysis | Source | ||
DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |