압력반사는 혈압 변화에 반응하는 자율신경계의 심박수 조절 메커니즘입니다. 우리는 생쥐의 심전도와 혈압을 연속적이고 동시에 측정하기 위해 원격 측정 송신기를 이식하는 수술 기술을 설명합니다. 이것은 심혈관 질환의 중요한 예후 지표인 자발적인 압력반사 민감도를 결정할 수 있습니다.
혈압(BP)과 심박수(HR)는 모두 자율신경계(ANS)에 의해 조절되며 반사 메커니즘으로 인해 밀접하게 얽혀 있습니다. 압력반사는 동맥 혈압의 급성, 단기 변화에 대응하고 상대적으로 좁은 생리학적 범위에서 혈압을 유지하는 핵심 항상성 메커니즘입니다. BP는 대동맥궁과 경동맥동에 위치한 압수용기에 의해 감지됩니다. 혈압이 변하면 신호가 중추 신경계로 전달된 다음 자율 신경계의 부교감 및 교감 신경 분지로 전달되어 HR을 조정합니다. 혈압이 상승하면 HR이 반사적으로 감소하고 혈압이 떨어지면 HR이 반사적으로 증가합니다.
압력 반사 민감도(BRS)는 동맥 혈압의 변화와 그에 상응하는 HR 변화 사이의 정량적 관계입니다. 심혈관 질환은 종종 압력 반사 기능 장애와 관련이 있습니다. 다양한 연구에서 감소된 BRS는 예를 들어 심부전, 심근 경색, 또는 관상 동맥 질환에서 보고되었습니다.
BRS를 결정하려면 BP와 HR의 정보가 필요하며, 원격 측정 장치를 사용하여 동시에 기록할 수 있습니다. 수술 절차는 압력 센서를 왼쪽 경동맥에 삽입하고 동맥압을 모니터링하기 위해 대동맥궁에 팁을 배치한 다음 송신기와 ECG 전극을 피하 배치하는 것으로 시작하여 설명됩니다. 또한 수술 후 집중 관리 및 진통제 관리에 대해서도 설명합니다. 수술 후 회복의 2 주 기간 후, 의식이 있고 구속되지 않은 마우스에서 장기 ECG 및 혈압 기록이 수행됩니다. 마지막으로, 고품질 기록의 예와 시퀀스 방법을 사용한 자발적 압력수용체 민감도 분석이 포함됩니다.
동맥 압력 수용체 반사는 동맥 혈압 (ABP)의 단기 및 아마도 장기 1,2 조절을 제공하는 인간의 주요 피드백 제어 시스템입니다. 이 반사는 생리적 또는 환경적 유발 요인에 대한 반응으로 발생하는 BP의 섭동을 완충합니다. 심박수, 박출량 및 전체 말초 동맥 저항의 즉각적인 반사 변화를 제공합니다. 반사는 대동맥궁과 경동맥동의 감각 신경 종말에서 시작됩니다. 이 신경 말단은 동맥 압수용기를 구성합니다. 대동맥궁에 있는 신경 말단의 체마타는 결절 신경절에 위치하는 반면 경동맥동의 신경 말단은 소동맥 신경절에 있습니다. 반사는 혈압 상승에 의해 유발되며, 이는 압력 수용체 신경 말단을 늘리고 활성화합니다 (그림 1A). 활성화는 구심성 대동맥 억제기 및 경동맥 신경을 통해 중앙에서 뇌관 솔리타리(tractus solitarii) 핵 및 미주 신경의 등쪽 핵과 같은 심혈관 뇌간 핵으로 전달되는 활동 전위 발리를 초래합니다. 구 심성 신경 활동의 변화는 자율 원심성 활동을 조절합니다. 압력 수용체 신경의 활동이 증가하면 교감 신경이 감소하고 부교감 신경 활동이 증가합니다. 따라서 압력수용체 활성화의 결과는 심박수, 심박출량, 혈관 저항의 감소이며, 이는 함께 혈압 상승을 상쇄하고 완충한다3. 대조적으로, 압력수용체 신경의 활동 감소는 교감신경을 증가시키고 부교감신경 활동을 감소시켜 심박수, 심박출량 및 혈관 저항을 증가시켜 혈압 감소를 상쇄합니다.
인간과 동물을 대상으로 한 수많은 연구에서 압력수용체 반사는 운동4, 수면5, 열 스트레스6 또는 임신7과 같은 생리학적 조건에서 조절될 수 있음이 밝혀졌다. 또한 압력반사가 고혈압, 심부전, 심근경색 및 뇌졸중과 같은 심혈관 질환에서 만성적으로 손상된다는 증거가 있습니다. 사실, 압력반사 기능장애는 또한 여러 심혈관 질환에서 예후 마커로 활용된다 8,9,10. 또한, 압력반사의 기능 장애는 ANS의 장애에도 존재합니다. 건강 및 질병 상태에 대한 압력 수용체 반사의 중요성을 감안할 때, 이 반사의 생체 내 추정은 특정 심각한 임상적 의미를 지닌 자율 신경 및 심혈관 연구의 중요한 구성 요소입니다.
유전자 마우스 라인은 심혈관 연구에서 필수적인 도구입니다. 이러한 마우스 라인에 대한 생체 내 연구는 심혈관 생리학 및 병태생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며 많은 경우 심혈관 질환에 대한 전임상 모델 시스템 역할을 합니다. 여기에서는 의식이 있고 구속되지 않고 자유롭게 움직이는 마우스에서 원격 측정 생체 내 ECG 및 혈압 기록을 위한 프로토콜을 제공하고 시퀀스 방법을 사용하여 이러한 기록에서 압력 반사 감도를 결정할 수 있는 방법을 설명합니다(그림 1B). 수축기 혈압(SBP) 및 RR 간격의 박동 간 시리즈가 HR의 반사 적응과 함께 SBP의 자발적인 증가 또는 감소 동안 3개 이상의 박동의 짧은 시퀀스에 대해 스크리닝되기 때문에 적용된 방법을 시퀀스 방법이라고 합니다. 이 방법은 자발적인 반사 메커니즘만 조사되기 때문에 압력 반사 감도 측정의 황금 표준입니다. 이 기술은 혈압 변화를 유도하기 위해 혈관 작용 약물 주입과 같은 침습적 절차를 포함하는 이전 기술보다 우수합니다.
그림 1: 시퀀스 방법을 사용한 압력반사 및 압력반사 민감도 평가의 개략도 . (A) 혈압이 급격히 상승하는 동안 압력반사의 경과. ABP의 단기적인 상승은 대동맥궁과 경동맥동에 위치한 압수용기에 의해 감지됩니다. 이 정보는 중추 신경계로 전달되어 부교감 신경 활동의 증가와 병행하여 교감 신경 활동의 감소를 유도합니다. 동방 결절 영역에 위치한 신경 말단에서 아세틸 콜린의 방출은 동방 결절 심박 조율기 세포에서 두 번째 메신저 cAMP의 감소를 유도하여 심박수를 감소시킵니다. 단기간의 혈압 감소는 반대의 효과가 있습니다. (B) 3개의 연속 비트의 위쪽 시퀀스(왼쪽 상단 패널) 및 아래쪽 시퀀스(오른쪽 상단 패널) 동안의 개략적인 BP 추적. 위쪽 시퀀스는 RR 간격(왼쪽 하단 패널)의 병렬 증가와 관련이 있으며, 이는 HR의 감소와 동일합니다. 다운 시퀀스는 RR 간격(오른쪽 하단 패널)의 병렬 감소와 연관되며, 이는 HR의 증가와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대체 방법에 대한 방법의 중요성
본 연구에서는 서열 방법을 사용하여 자발적인 BRS를 정량화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 ECG 및 BP 원격 측정으로 측정된 자발적인 BP 및 반사 HR 변화를 활용합니다. 이 방법의 장점은 측정이 수행되는 방으로 걸어 들어가거나 약물 주입에 필요한 신체적 상호 작용에 의해 동물을 방해하지 않고 의식적이고 자유롭게 움직이며 구속되지 않은 동물에 두 매개 변수를 모두 기록 할 수 있다는 것입니다. 이 점은 이러한 교란이 HR 및 BP 기록을 심각하게 방해한다는 것이 분명하게 밝혀졌기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 약물 주입은 마우스의 고정이 필요하며, 이는 HR을 최대 650-700 bpm까지 증가시키는 최대 스트레스 반응을 유발합니다. 이러한 스트레스 반응을 피하기 위해 BRS는 이전에 마취된 마우스에서 결정되었습니다. 그러나 케타민/자일라진 또는 이소플루란과 같은 수의학에 사용되는 표준 마취제는 서맥을 유발하고 자율신경 반사 반응에 영향을 주어 이러한 접근법의 타당성과 결과 해석을 제한합니다. 이러한 한계를 부분적으로 극복하기 위해 복강 내로 약물을 방출할 수 있는 이식형 약물 전달 장치, 즉 삼투압 펌프가 사용되었습니다. 그러나 삼투압 펌프를 사용하면 이러한 장치의 적용을 제한하는 정의된 용량의 약물을 일시 투여하는 것이 불가능합니다. 또는 복잡한 주입 카테터17 약물을 투여하기 위해 마우스에 이식 할 수 있습니다. 그러나 이러한 카테터는 다루기 어렵고 원격 측정 장치 이식에 필요한 것과 유사한 수술 기술이 필요하며 자발적인 BRS 측정에 비해 과학적 결과가 적습니다. 약물 주사를 사용하여 BRS를 측정하는 것과 관련된 기술적 문제 외에도 약물 작용 자체와 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. BRS를 결정하기 위한 전통적인 접근 방식에는 혈관 작용 약물의 일시 주사가 포함됩니다. 그러나 혈관 수축제(예: 페닐에프린) 또는 혈관 확장제(예: 니트로프루시드 나트륨)의 일시 주사는 혈압 변화에 대한 반사 HR 적응을 위한 과도하고 비생리학적 자극으로 간주되었습니다18. 압력 수용체 반사의 자발적인 활동은 또한 스펙트럼 방법을 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 이러한 방법 중 하나는 특정 주파수 대역에서 HR의 변화와 혈압의 변화 사이의 비율을 계산하여 주파수 영역에서 BRS를 평가하는 것입니다18,19. 다른 스펙트럼 방법은 BP와 HR의 전달 함수의 결정 또는 BP와 HR 사이의 일관성의 정량화를 포함합니다20,21. 이러한 방법은 또한 자발적인 BP 및 HR 매개변수의 원격 측정 획득이 필요하며 자발적인 BRS를 결정하는 데 적합하지만 집약적인 계산 도구가 필요하고 적용하기 어렵습니다. 또한, 모든 스펙트럼 방법은 비정상 신호가 스펙트럼 방법의 적용을 배제한다는 한계를 가지고 있습니다. 특히, 호흡 리듬에 의해 유도된 스펙트럼 피크는 환자에게 호흡을 멈추도록 요청함으로써 인간 환자에서 감소될 수 있지만, 이것은 분명히 마우스에서는 불가능합니다. 따라서 신호 대 잡음비는 마우스에서 매우 낮은 경우가 많습니다. 위에서 논의한 방법의 한계를 감안할 때, 우리는 마우스에서 BRS를 결정하기 위한 서열 방법을 선호합니다. 이 방법의 상당한 장점은 실제 조건에서 자발적인 BRS에 대한 데이터를 제공하는 비침습적 기술이라는 사실입니다22. 한 가지 더 중요한 점은 시퀀스 방법을 사용하여 분석된 시퀀스의 지속 시간이 3-5비트를 포함하여 매우 짧다는 것입니다. 미주 신경에 의한 HR의 반사 조절은 매우 빠르고 이러한 시퀀스의 시간 프레임 내에 있습니다. 따라서 서열 방법은 BRS에 대한 미주 신경의 기여도를 평가하는 데 매우 적합합니다. 대조적으로, 교감 신경계에 의한 조절은 훨씬 느립니다. 사실, 이러한 짧은 시퀀스 동안 교감 신경계의 활동은 거의 일정하다고 가정할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 미주 신경 활동에 의해 구동되는 HR의 반사 변화를 선택적으로 감지하도록 맞춤화된다.
BRS 데이터의 해석
BRS 기능 장애 또는 BRS 데이터 자체를 해석하려면 압력 수용체 반사에 관여하는 개별 기능 수준을 고려하는 것이 중요합니다. 뉴런 수준에서는 반사의 구심성, 중추성 또는 원심성 성분이 영향을 받을 수 있다23. 심혈관 수준에서, ANS 입력에 대한 동방 결절의 감소되거나 과장된 반응성이 존재할 수 있다11,24. 각 레벨의 변경은 BRS의 변경으로 이어질 수 있습니다. 신경 및/또는 심장 메커니즘이 BRS, 심장 또는 뉴런 특이적 유전자 결실에서 관찰된 변화에 책임이 있는지 여부를 분석하기 위해 녹다운 또는 유전자 편집 접근법을 사용할 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계
이 프로토콜에서 가장 정교하고 중요한 단계는 좌경동맥의 준비 및 캐뉼라입니다(2.3단계). 꼬리 폐색 봉합사의 장력은 캐뉼러 삽입 전에 혈류를 완전히 멈출 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. 그렇지 않으면 캐뉼라 삽입 중 혈액이 조금만 누출되어도 시야가 심각하게 제한되거나 마우스가 출혈로 사망 할 수 있습니다. 캐뉼러 삽입은 첫 번째 시도에서 성공해야 합니다. 그러나 첫 번째 시도가 실패하면 조심스럽게 캐뉼러 삽입을 다시 시도 할 수 있습니다.
목에서 왼쪽 옆구리까지의 정중선 절개 및 피하 터널(2.3단계)은 힘 없이 송신기를 쉽게 삽입할 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 송신기를 제자리에 유지하기 위해 가능한 한 작아야 합니다. 그렇지 않으면 봉합사 재료 또는 조직 접착제로 제자리에 고정해야 합니다. 생쥐는 매우 섬세한 피부를 가지고 있기 때문에 송신기의 터널이 너무 작 으면 피부 괴사가 발생할 수 있습니다.
ECG 전극이 너무 길어서 피하 터널에 맞지 않는 경우(단계 2.4), 전극을 적절한 길이로 줄여 새로운 팁을 형성해야 합니다. 전극은 리드의 전체 길이에 걸쳐 본체에 평평하게 놓여야 합니다. 전극이 너무 길면 동물을 방해하고 상처를 열어 송신기를 제거하려고 시도하여 조직 자극 및 상처 열개의 위험이 있습니다. 물론 너무 짧은 리드는 확장 할 수 없으며이 경우 전극이 아인트호벤 II 구성에 해당하는 방식으로 배치 될 수 없습니다. 따라서 동일한 성별, 체중 및 유전적 배경을 가진 죽은 마우스에서 ECG 리드의 최적 길이를 결정하는 것이 좋습니다.
마우스가 정상적인 일주기 리듬을 가지고 있지 않고 이것이 연구 중인 마우스 라인의 표현형이 아닌 경우 송신기 이식 후 더 긴 회복 시간을 주어야 합니다(단계 2.7). 일주기 리듬이 방해받는 또 다른 이유는 측정 중에 동물 시설이나 방에 들어오는 사람의 부적절한 음향 격리일 수 있습니다.
ECG, BP 및 BRS 데이터 분석은 간단합니다 (2.8 단계). 가장 중요한 단계는 이소성 박동, 부비동 일시 중지, 부정맥 에피소드 또는 저품질 신호가 있는 섹션을 데이터 분석에서 제외하는 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 독일 연구 재단 [FE 1929 / 1-1 및 WA 2597 / 3-1]의 지원을 받았습니다. 우수한 기술 지원을 해주신 Sandra Dirschl과 수의학적 조언을 해주신 Julia Rilling에게 감사드립니다.
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