Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling
Summary
Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.
Abstract
Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.
Introduction
Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungengesehen 3,4. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene5. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass die Genregulation auf anderen Ebenen auch zur Koordination der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beiträgt6,7,8,9,10. Daher wird die Adressierung der translationalen Kontrollprogramme unser Verständnis der Mechanismen, die der Entscheidung über das Schicksal von neuronalen Stammzellen und der Entwicklung des Gehirns zugrunde liegen, erheblich voranbringen.
Drei Haupttechniken mit unterschiedlichen Stärken wurden weit verbreitet, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, einschließlich Ribosom-Profiling, Übersetzen ribososome-Affinitätsreinigung (TRAP) und Polysome-Profiling. Ribosome Profiling verwendet RNA-Sequenzierung, um ribosome-geschützte mRNA-Fragmente zu bestimmen, was die globale Analyse der Anzahl und Position der Übersetzung von Ribosomen auf jedem Transkript ermöglicht, um indirekt die Translationsrate abzuleiten, indem man sie mit transkriptionsüberfluss11vergleicht. TRAP nutzt epitopgemarkierte ribosomale Proteine, um ribosomgebundene mRNAs12zu erfassen. Da die markierten ribosomalen Proteine mit genetischen Ansätzen in bestimmten Zelltypen exprimiert werden können, ermöglicht TRAP die zelltypspezifische Analyse der Translation. Im Vergleich dazu bietet die Polysomenprofilierung, die die Saccharosedichtegradientenfraktionierung verwendet, um freie und schlecht übersetzte Portionen (leichtere Monosomen) von denen zu trennen, die aktiv durch Ribosomen (schwerere Polysomen) übersetzt werden, eine direkte Messung der Ribosomdichte auf mRNA13. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, die Übersetzung spezifischer mRNA von Interesse sowie genomweite Translatome-Analyse14zu studieren.
In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll der Polysomenprofilierung zur Analyse der sich entwickelnden Mausgroßhirnrinde. Wir verwenden ein selbst montiertes System, um Saccharosedichtegradienten vorzubereiten und Brüche für nachgelagerte Anwendungen zu sammeln. Das hier vorgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Arten von Geweben und Organismen zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen14 zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 bis G.Y.) finanziert. G.Y. ist ein Canada Research Chair. S.K. wurde vom Mitacs Globalink Graduate Fellowship und dem ACHRI Graduate Student Scholarship finanziert.
Materials
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
Referências
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
