Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et des^{gliales 1,2} . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental^3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques⁵. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les résultats récents suggèrent que la régulation de gène à d’autres niveaux contribue également à la coordination de la prolifération et de la différenciation neurales^{de cellules souches 6,7,8,9,10.} Ainsi, la résolution des programmes de contrôle translationnel fera grandement progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la décision sur le sort des cellules souches neurales et au développement du cerveau.

Trois techniques principales avec des forces différentes ont été largement appliquées pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, y compris le profilage ribosome, la traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) et le profilage polysome. Le profilage ribosome utilise le séquençage de l’ARN pour déterminer les fragments d’ARNm protégés par le ribosome, ce qui permet à l’analyse globale du nombre et de l’emplacement des ribosomes de traduction sur chaque transcription d’inférer indirectement le taux de traduction en le comparant à l’abondance de^{transcription 11}. TRAP tire parti des protéines ribosomiques marquées d’épitope pour capturer les ARNM ribosome-liés¹². Étant donné que les protéines ribosomiques étiquetées peuvent être exprimées dans des types de cellules spécifiques à l’aide d’approches génétiques, TRAP permet l’analyse de la traduction d’une manière spécifique au type de cellule. En comparaison, le profilage polysome, qui utilise la fractionnement du gradient de densité saccharose pour séparer la partie libre et mal traduite (monosomes plus légers) de ceux qui sont activement traduits par des ribosomes (polysomes plus lourds), fournit une mesure directe de la densité ribosome sur^{l’ARNm 13}. Un avantage de cette technique est sa polyvalence pour étudier la traduction de l’ARNm spécifique d’intérêt ainsi que l’analyse du traduislatome à l’échelle^{du génome 14}.

Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé de profilage polysome pour analyser le cortex cérébral de souris en développement. Nous utilisons un système assemblé à domicile pour préparer les gradients de densité du saccharose et recueillir des fractions pour les applications en aval. Le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour analyser d’autres types de tissus et d’organismes.