Summary

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Published: October 20, 2020
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Abstract

Los logros tecnológicos de la proteómica cuantitativa basada en espectrometría de masas (EM) abren muchas vías no descubiertas para analizar el proteoma global de un organismo en condiciones variables. Esta poderosa estrategia aplicada a las interacciones de patógenos microbianos con el huésped deseado caracteriza ampliamente ambas perspectivas hacia la infección. En este documento, el flujo de trabajo describe la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) del infectoma de Cryptococcus neoformans, un patógeno intracelular facultativo facultativo fúngico que es el agente causal de la enfermedad mortal cryptococcosis, en presencia de células de macrófago inmortalizadas. El protocolo detalla las técnicas adecuadas de preparación de proteínas para células patógenas y mamíferos dentro de un solo experimento, lo que resulta en la presentación adecuada de péptidos para el análisis de cromatografía líquida (LC)-EM/EM. La naturaleza genérica de alto rendimiento de LFQ permite un amplio rango dinámico de identificación y cuantificación de proteínas, así como transferibilidad a cualquier entorno de infección de patógeno huésped, manteniendo una sensibilidad extrema. El método está optimizado para catalogar perfiles extensos e imparciales de abundancia de proteínas de un patógeno dentro de condiciones que imitan infecciones. Específicamente, el método demostrado aquí proporciona información esencial sobre la patogénesis C. neoformans, como la producción de proteínas necesaria para la virulencia e identifica proteínas huésped críticas que responden a la invasión microbiana.

Introduction

La prevalencia de infecciones fúngicas invasivas está aumentando enormemente y está correlacionada con tasas de mortalidad inaceptablemente altas, más comúnmente notificadas en individuos con predisposiciones inmunodeficientes1. Cryptococcus neoformans es un famoso patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivir intracelularmente dentro de las células de macrófago huésped. La intervención antifúngica inadecuada da como resultado la difusión fúngica y manifestaciones potencialmente mortales de meningitis criptocócica y meningoencefalitis2,3. El aumento global del estatus inmunodeprimido ha exigido un aumento paralelo en el uso de agentes antifúngicos, en el que muchas especies fúngicas, incluyendo C. neoformans, han evolucionado cada vez más la resistencia hacia4,5,6. Por lo tanto, es imperativo implementar tecnologías sólidas y eficientes para responder a preguntas biológicas vitales con respecto a la respuesta de la defensa del huésped y la patogénesis microbiana.

La nueva era del avance tecnológico en espectrometría de masas (EM), incluida la generación de potentes tuberías computacionales y bioinformáticas, proporciona la base para una visión integrativa para el análisis a gran escala de la investigación de patógenos de host7,8. El análisis proteómico convencional impulsado por patógenos comúnmente perfila la vista de la infección desde la perspectiva del huésped o patógeno, incluyendo metodologías integrales tales como perfiles de correlación de proteínas, cromatografía de afinidad combinada con proteómica e interactómica9. Las investigaciones sobre la virulencia de patógenos peligrosos en un sistema huésped son de inmensa importancia clínica; sin embargo, la aplicación de un análisis de doble perspectiva en un solo experimento se consideraba antes inalcanzable. Por ejemplo, la perspectiva del patógeno hacia la infección a menudo se desborda por proteínas huésped altamente abundantes, lo que resulta en una sensibilidad reducida para la detección de proteínas fúngicas de baja abundancia7. Además, la alta complejidad de la muestra invita a muchos objetivos a investigar en un solo sistema experimental y resulta difícil de dilucidar los mecanismos de acción para una proteína patógena específica.

La proteómica ascendente es una técnica popular de EM que permite la preparación manejable de muestras, en la que los péptidos se generan mediante digestión enzimática específica de la secuencia seguida de separación, identificación y cuantificación de cromatografía líquida por MS10,11. Aquí, presentamos un método que demuestra una estrategia de adquisición dependiente de los datos con el propósito de lograr una cobertura imparcial de un proteoma o ‘infectoma’ basado en infecciones. En concreto, la cuantificación libre de etiquetas (LFQ) arroja la dependencia de las etiquetas químicas o metabólicas para una identificación robusta y precisa de los cambios en el nivel de proteínas en múltiples proteomas, reduciendo la manipulación y el procesamiento de muestraspasos 12,13. Esta aplicación universal interroga las proteínas producidas en un momento dado dentro de una célula independientemente de cualquier producción de proteína esperada; por lo tanto, se pueden descubrir nuevos conocimientos que son críticos para la infección.

El flujo de trabajo descrito aquí está optimizado para explorar los cambios en el nivel de proteínas de C. neoformans durante las condiciones de imitación de infecciones con células inmunes huésped (Figura 1). En lugar de basarse en el aislamiento y separación de los tipos celulares, este enfoque extrae el proteoma huésped y patógeno juntos, y utiliza la separación bioinformática utilizando dos bases de datos específicas del organismo para distinguir la producción de proteínas específicas de especies. Este método ofrece ventajas para un número ilimitado de muestras que se procesarán sin los costosos pasos de preparación necesarios en estudios de etiquetado o fraccionamiento basados en isótopos. Además, este flujo de trabajo admite protocolos optimizados de extracción de proteínas transferibles a una amplia gama de patógenos fúngicas y bacterianos capaces de atacar e infectar las células inmunes huésped. En general, este protocolo describe los pasos para completar una extracción de proteínas imparcial y procesamiento de muestras para EM de alta resolución, seguido de datos y análisis estadísticos, capaces de proporcionar una gran cantidad de conocimiento de proteínas fúngicas significativas para la infección combinadas con un perfil integral de la respuesta de defensa del huésped.

Protocol

Una línea inmortalizada de macrófagos derivados de ratones BALB/c fueron utilizados para el siguiente protocolo aprobado por el Protocolo de Utilización Animal 4193 de la Universidad de Guelph. En particular, otras cepas de ratones u otras fuentes de células inmortalizadas se pueden aplicar al protocolo descrito con pruebas suficientes para optimizar los parámetros detallados. El siguiente protocolo navegará por los pasos que comienzan con un vial congelado de células de macrófago. Las células se almacenan en 10…

Representative Results

El protocolo descrito anteriormente permite la identificación y cuantificación de proteínas derivadas tanto del patógeno fúngico, C. neoformans,como del huésped, células de macrófago, en un solo experimento. Tras el co-cultivo, las células se recogen y procesan juntas y se separan bioinformáticamente en función de perfiles péptidos específicos de cada especie. Este es un enfoque poderoso para definir la interacción de la relación huésped-patógeno durante la infección. El número de proteínas i…

Discussion

Los pasos críticos en el protocolo incluyen la preparación de células de macrófago y la recolección de muestras de co-cultivo para el procesamiento de proteínas con una interrupción mínima de las células. Es importante realizar pasos de lavado, inoculación y eliminación de células de macrófago adherentes de forma suave y cuidadosa para evitar la lisis innecesaria de las células antes de la recolección. Establecer el MOI correcto para el experimento también es crítico, ya que la inoculación con un MOI ex…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Jonathan Krieger de Bioinformatics Solutions Inc. por operar el espectrómetro de masas para experimentos representativos, así como a los miembros del grupo Geddes-McAlister por su ayuda con la configuración experimental y la retroalimentación manuscrita. Los autores reconocen el apoyo a la financiación, en parte, de la Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), y la Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) para J.G.M., así como NSERC Canada Graduate Scholarship – Masters and Ontario Graduate Scholarship for B.B., y Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology for A.S..

Materials

100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

Referências

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
  2. Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
  3. Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
  4. Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
  5. Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
  6. Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
  7. Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
  8. Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
  9. Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
  10. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  11. Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
  12. Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  13. Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
  14. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  15. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  16. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
  17. Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
  18. Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
  19. Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
  20. Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
  21. Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
  22. Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
  23. Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
  24. Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  25. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  26. Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
  27. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
  28. Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
  29. Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
  30. Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).

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Citar este artigo
Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

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