Vi presenterer en metode spesielt skreddersydd for å avbilde hele hjernen til voksen Drosophila under atferd og som svar på stimuli. Hodet er plassert for å tillate optisk tilgang til hele hjernen, mens flyet kan bevege bena og antennene, spissen av proboscis, og øynene kan motta sensoriske stimuli.
Vi presenterer en metode utviklet spesielt for å avbilde hele Drosophila-hjernen under pågående oppførsel som å gå. Hodefiksering og avhandling er optimalisert for å minimere deres innvirkning på atferd. Dette oppnås først ved å bruke en holder som minimerer bevegelseshindringer. Baksiden av flyets hode limes til denne holderen i en vinkel som gir optisk tilgang til hele hjernen mens du beholder flyets evne til å gå, brudgommen, lukten, smaken og se. Baksiden av hodet er dissekert for å fjerne vev i den optiske banen og muskler som er ansvarlige for hodebevegelsesgjenstander. Flyhjernen kan deretter avbildes for å registrere hjerneaktivitet, for eksempel ved hjelp av kalsium- eller spenningsindikatorer, under spesifikke atferd som å gå eller stelle, og som svar på forskjellige stimuli. Når den utfordrende disseksjonen, som krever betydelig praksis, har blitt mestret, gjør denne teknikken det mulig å registrere rike datasett relatert til hele hjerneaktivitet til atferd og stimulansresponser.
Avbildning av hjerneaktivitet ved hjelp av ulike teknikker har forsterket forståelsen av hjernefunksjon. Hos mennesker har hjerneavbildningsteknikker viktige begrensninger: mens funksjonell magnetisk resonansavbildning (fMRI) tilbyr romlig-temporal oppløsning langt under enkel nevronoppløsning, tillater raske teknikker som elektroencefalografi (EEG) bare indirekte og delvis tilgang til hjernen1. I tilstrekkelig store dyremodeller som gnagere tillater registrering av fluorescerende aktivitetssensorer (f.eks. GCaMP) ved hjelp av hodemonterte mikroskoper å observere hjerneaktivitet mens dyret beveger seg i sitt miljø2. Likevel gir disse teknikkene for tiden bare tilgang til en liten del av hjernen. Hodefaste dyr kan avbildes mer omfattende, men dekningen er fortsatt delvis (f.eks. cortex-overflaten3). Det er bare hos små dyr, som sebrafisk larver, C. elegans og Drosophila at hele hjernen kan avbildes med tidsmessig og romlig oppløsning på nivået av eller nær enkelt nevroner4.
D. melanogaster er spesielt lovende fordi den lenge har blitt brukt som en genetisk modellorganisme5 og kraftige genetiske verktøy er utviklet6. Supplert med det nye anatomiske nettverket i stor skala avledet fra elektronmikroskopi7, kan flyet gi unike muligheter til å studere kompleks hjernedynamikk generert på et stort nettverk8. Selv om kutiklet ikke er gjennomsiktig, og dermed må fjernes for å avbilde hjernen, har in vivo funksjonell avbildning blitt mer og mer vanlig siden den første studien i 20029 og flere protokoller er allerede publisert. Det er imidlertid Disse metodene innebærer enten å skille flyhodet fra kroppen10, sterkt begrense flyets bevegelser og / eller svar på stimuli11,12,13,14,15, eller bare tillate en liten del av hjernen som skal avbildes9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. For å utfylle disse likevel kraftige tilnærmingene, utviklet vi nylig et preparat for å avbilde hele hjernen under oppførsel og respons på ulike stimuli28.
Her bygger vi videre på denne studien for å presentere en metode som er spesielt utviklet for å avbilde hele hjernen mens fluen utfører semi-naturalistisk oppførsel (dvs. gange og grooming) og reagerer på sensoriske stimuli. Dette oppnås ved å bruke en observasjonsholder designet for å gi tilgang til hele hjernen fra dorsal-posterior-siden, samtidig som antennene og proboscis er intakte, og tillater flyet å bevege bena for å gå (f.eks. på en luftdempingskule). Trinn for dissekering av baksiden av hodet har blitt raffinert for hastighet, reproduserbarhet, og for å minimere effekten på flyets levedyktighet og mobilitet.
Drosophila er et av de sjeldne voksne dyrene der hele hjernen kan avbildes under kompleks atferd. Her presenterer vi en metode for å forberede fluen og utsette hele hjernen for å avbilde pågående hele hjerneaktivitet. Flere viktige punkter bør noterres.
Dissekering av et lite dyr som D. melanogaster er utfordrende. Metoden krever dermed mye øvelse og tålmodighet for å mestre den. Men etter trening tar prosedyren mindre enn 30 minutter og gir reproduserbare resultater.
Metoden vi presenterte har ytterligere begrensninger. For det første fører vippehodet fra sin naturlige posisjon til å strekke nakken som kan være skadelig for bindevev, nerver eller muskler. For det andre, selv om ventral subesophageal zone (SEZ) er optisk tilgjengelig, er den under den halvgjennomsiktige spiserøret, noe som reduserer intensiteten og oppløsningen i dette området. Til slutt, selv om holderen er utenfor rekkevidde i de fleste retninger, innser flyet fortsatt noen ganger sin tilstedeværelse og skyver på den for å prøve å unnslippe.
Til tross for disse begrensningene vil de omfattende dataene hentet fra hele hjerneavbildning under atferd og respons på stimuli gjøre det mulig å dechiffrere hjernefunksjonen på nivået av hele nettverket når dyret samhandler med og navigerer i komplekse, naturalistiske miljøer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Heidi Miller-Mommerskamp for teknisk hjelp og Iveth Melissa Guatibonza Arevalo for nyttige kommentarer til manuskriptet. Innledende versjoner av protokollen ble utviklet i laboratoriet til Ralph Greenspan. Dette arbeidet ble støttet av den tyske forskningsstiftelsen (DFG), spesielt gjennom et tilskudd FOR2705 (TP3) til IGK, og av Simons foundation (Aimon – 414701) og Kavli Institute for Brain and Mind (tilskuddsnummer #2017-954) mottatt av SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |