Presentamos un método específicamente adaptado a la imagen de todo el cerebro de drosophila adulto durante el comportamiento y en respuesta a estímulos. La cabeza está posicionada para permitir el acceso óptico a todo el cerebro, mientras que la mosca puede mover sus piernas y las antenas, la punta del proboscis, y los ojos pueden recibir estímulos sensoriales.
Presentamos un método desarrollado específicamente para imaginar todo el cerebro de Drosophila durante el comportamiento continuo como caminar. La fijación y disección de la cabeza están optimizadas para minimizar su impacto en el comportamiento. Esto se logra primero mediante el uso de un soporte que minimiza los obstáculos de movimiento. La parte posterior de la cabeza de la mosca está pegada a este soporte en un ángulo que permite el acceso óptico a todo el cerebro mientras conserva la capacidad de la mosca para caminar, acicalarse, oler, saborear y ver. La parte posterior de la cabeza se disecciona para eliminar los tejidos en la trayectoria óptica y los músculos responsables de los artefactos de movimiento de la cabeza. El cerebro de la mosca se puede tomar posteriormente imágenes para registrar la actividad cerebral, por ejemplo, utilizando indicadores de calcio o voltaje, durante comportamientos específicos como caminar o acicalarse, y en respuesta a diferentes estímulos. Una vez que la disección desafiante, que requiere una práctica considerable, ha sido dominada, esta técnica permite registrar conjuntos de datos enriquecidos que relacionan toda la actividad cerebral con el comportamiento y las respuestas de estímulo.
La actividad cerebral por imágenes utilizando varias técnicas ha profundizado la comprensión de la función cerebral. En los seres humanos, las técnicas de diagnóstico por imágenes cerebrales tienen limitaciones importantes: mientras que la resonancia magnética funcional (fMRI) ofrece una resolución espacio-temporal muy por debajo de la resolución de una sola neurona, las técnicas rápidas como la electroencefalografía (EEG) sólo permiten el acceso indirecto y parcial al cerebro1. En modelos animales suficientemente grandes como roedores, la grabación de sensores de actividad fluorescente (por ejemplo, GCaMP) utilizando microscopios montados en la cabeza permite observar la actividad cerebral mientras el animal se mueve en su entorno2. Sin embargo, estas técnicas actualmente dan acceso sólo a una pequeña porción del cerebro. Los animales fijos en la cabeza se pueden imaginar de forma más completa, pero la cobertura sigue siendo parcial (por ejemplo, la superficie de la corteza3). Es sólo en animales pequeños, como las larvas de pez cebra, C. elegans y Drosophila que todo el cerebro se puede imaginar con resolución temporal y espacial a nivel de o cerca de neuronas individuales4.
D. melanogaster es particularmente prometedor porque durante mucho tiempo se ha utilizado como un organismo modelo genético5 y potentes herramientas genéticas se han desarrollado6. Complementada con la nueva red anatómica a gran escala derivada de la microscopía electrónica7,la mosca podría proporcionar oportunidades únicas para estudiar dinámicas cerebrales complejas generadas en una red a gran escala8. Aunque la cutícula no es transparente, y por lo tanto debe ser eliminada para tomar imágenes del cerebro, las imágenes funcionales in vivo se han vuelto cada vez más comunes desde el primer estudio en 20029 y ya se han publicado varios protocolos. Sin embargo, estos métodos implican separar el cabezal de mosca del cuerpo10,restringir severamente los movimientos de la mosca y/o las respuestas a los estímulos11,12,13,14,15,o sólo permitir una pequeña parte del cerebro a ser imagen9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Para complementar estos enfoques sin embargo poderosos, recientemente desarrollamos una preparación para imaginar todo el cerebro durante el comportamiento y las respuestas a varios estímulos28.
Aquí, nos basamos en este estudio para presentar un método desarrollado específicamente para imaginar todo el cerebro mientras la mosca realiza un comportamiento semi-naturalista (es decir, caminar y acicalarse) y responde a estímulos sensoriales. Esto se logra mediante el uso de un soporte de observación diseñado para dar acceso a todo el cerebro desde el lado dorsal-posterior, dejando las antenas y el proboscis intactos, y permitiendo que la mosca mueva sus piernas para caminar (por ejemplo, en una bola acolchada por aire). Los pasos para diseccionar la parte posterior de la cabeza se han refinado para la velocidad, reproducibilidad y minimizar su efecto sobre la viabilidad y movilidad de la mosca.
La drosophila es uno de los animales adultos raros donde todo el cerebro puede ser imagen durante comportamientos complejos. Aquí, presentamos un método para preparar la mosca y exponer todo su cerebro a la imagen de toda la actividad cerebral. Hay que tener en cuenta varios puntos importantes.
Diseccionar un animal pequeño como D. melanogaster es un reto. Por lo tanto, el método requiere mucha práctica y paciencia para dominarlo. Sin embargo, después del entrenamiento, el procedimiento tarda menos de 30 minutos y produce resultados reproducibles.
El método que presentamos tiene limitaciones adicionales. En primer lugar, inclinar la cabeza de la mosca desde su posición natural conduce a estirar el cuello que podría ser perjudicial para el tejido conectivo, los nervios o el músculo. En segundo lugar, aunque la zona subesofágica ventral (SEZ) es ópticamente accesible, está por debajo del esófago semitransparente, lo que disminuye la intensidad y resolución en esta área. Finalmente, aunque el soporte está fuera de su alcance en la mayoría de las direcciones, la mosca todavía a veces se da cuenta de su presencia y empuja sobre ella para tratar de escapar.
A pesar de estas limitaciones, los datos completos obtenidos de imágenes cerebrales enteras durante el comportamiento y las respuestas a los estímulos harán posible descifrar la función cerebral a nivel de toda la red cuando el animal interactúa y navega por entornos complejos y naturalistas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Heidi Miller-Mommerskamp por ayuda técnica y a Iveth Melissa Guatibonza Arévalo por sus comentarios útiles sobre el manuscrito. Las versiones iniciales del protocolo fueron desarrolladas en el laboratorio de Ralph Greenspan. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG), en particular a través de una subvención FOR2705 (TP3) a IGK, y por la fundación Simons (Aimon – 414701) y el Instituto Kavli para el Cerebro y la Mente (número de subvención #2017-954) recibido por SA.
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |