דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת
Summary
כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.
Abstract
הגונד העוברי הזכרי Drosophila melanogaster הוא מודל יתרון לחקר היבטים שונים של ביולוגיה התפתחותית, כולל, אך לא רק, התפתחות תאי נבט, ביולוגיה של פירנ”א והיווצרות נישה. כאן, אנו מציגים טכניקת דיסקציה כדי לצלם בשידור חי את ה- gonad ex vivo בתקופה שבה הדמיה חיה in vivo אינה יעילה מאוד. פרוטוקול זה מתווה כיצד להעביר עוברים לצלחת הדמיה, לבחור עוברים זכריים בשלבים מתאימים ולנתח את הגונד מהרקמה הסובבת אותו תוך שמירה על שלמותו המבנית. לאחר הניתוח, ניתן לצלם את הגונדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להמחיש תהליכים תאיים דינמיים. הליך הנתיחה דורש תזמון ומיומנות מדויקים, אך אנו מספקים תובנה כיצד למנוע טעויות נפוצות וכיצד להתגבר על אתגרים אלה. למיטב ידיעתנו זהו פרוטוקול הנתיחה הראשון של הגונד העוברי דרוזופילה , והוא יאפשר הדמיה חיה בחלון זמן בלתי נגיש אחרת. ניתן לשלב טכניקה זו עם מניפולציות מהונדסות פרמקולוגיות או מסוג תאים ספציפיים כדי לחקור תהליכים דינמיים המתרחשים בתוך או בין התאים בסביבתם הגונדלית הטבעית.
Introduction
אשכי Drosophila melanogaster שימשו פרדיגמה להבנתנו תהליכים תאיים דינמיים רבים. מחקרים על מודל זה שפכו אור על ויסות חלוקת תאי גזע 1,2,3, התפתחות תאי נבט 4,5, ביולוגיה של פירנ”א 6,7,8, ואירועי איתות תאי גזע נישה 9,10,11,12,13. מודל זה הוא יתרון מכיוון שהוא ניתן למתיחה גנטיתשל 14,15 והוא אחד הבודדים שבהם אנו יכולים לדמות תאי גזע חיים בסביבתם הטבעית 3,16,17,18. עם זאת, הדמיה חיה של מודל זה הוגבלה לרקמות בוגרות ולשלבים עובריים מוקדמים, והותירה פער בידע שלנו על דינמיקה של גונדאל בעובר המאוחר, השלב המדויק שבו הנישה נוצרת לראשונה ומתחילה לתפקד.
הגונד העוברי בשלב מאוחר הוא כדור, המורכב מתאי נישה סומאטיים בחלק הקדמי, ותאי נבט הנספים על ידי תאי גונדל סומטיים באזורים אחוריים יותר19. ניתן לדמות איבר זה חי ב- vivo עד שלב העוברי המוקדם 1717,20,21. הדמיה נוספת נמנעת עקב ייזום התכווצויות שרירים בקנה מידה גדול. התכווצויות אלה כה חמורות עד שהן דוחפות את הגונד אל מחוץ למסגרת ההדמיה, ותנועה כזו אינה ניתנת לתיקון באמצעות תוכנת הדמיה. המעבדה שלנו מעוניינת לחשוף את המנגנונים של היווצרות נישה, המתרחשת בתקופה חמקמקה זו להדמיה חיה. לכן, יצרנו גישת ex vivo לדימוי חי של הגונד החל משלב 16 העוברי, מה שמקל על חקר הדינמיקה של התאים בתקופה מכרעת זו של התפתחות הגונד. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו מראות כי הדמיית ex vivo זו משחזרת בנאמנות את פיתוח ה-in vivo gonad17. טכניקה זו היא הראשונה והיחידה מסוגה עבור הגונד העוברי של דרוזופילה.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הנתיחה הנדרש להדמיה חיה ex vivo של הגונד בשלבים העובריים המאוחרים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טיפולים פרמקולוגיים, או מניפולציה מהונדסת של שושלות תאים ספציפיות בתוך הגונד. באמצעות טכניקה זו, צילמנו בהצלחה את השלבים של היווצרות נישה של תאי גזע17. גישת הדמיה זו היא אפוא חיונית לתחום הביולוגיה של תאי הגזע, שכן היא תאפשר הדמיה של השלבים הראשונים של היווצרות נישה בזמן אמת בסביבתה הטבעית15,17. בעוד ששיטה זו מועילה לתחום הביולוגיה של תאי גזע, היא גם ישימה להדמיה של תהליכים דינמיים המתרחשים בגונד במהלך נקודת זמן התפתחותית זו, כולל סידור מחדש של תאים22, הידבקות תאים 2,12,23 ונדידת תאים23. פרוטוקול דיסקציה זה ישפר אפוא את הבנתנו לגבי תהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים של התאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך הגונדוגנזה, הגונד העוברי, ובמיוחד גומחת תאי הגזע בתוך הגונדהזכרי 15, עוברים שינויים מורפולוגיים מהירים. מנגנונים התפתחותיים העומדים בבסיס השינויים הדינמיים הללו מובנים בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות הדמיה חיה. עם זאת, בשלב העוברי 17, הדמיית in vivo של הגונד הופכת לב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ללינדזי ו. פלשארט וג’סטין סוי על תרומתם המשמעותית לפיתוח המוקדם של פרוטוקול זה. המחברים מודים לקהילת הזבובים על נדיבותם עם ריאגנטים, ובמיוחד לרות להמן ובנג’מין לין על מתנתם בשורה מס’5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ לפני פרסומה. במחקר זה נעשה שימוש במניות שהתקבלו ממרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה (NIH P40OD018537). עבודה זו נתמכה על ידי NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ו- R35GM136270 (S.D) וכן מענקי הכשרה T32GM007229 (B.W.) ו- F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
Referências
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Biologia do Desenvolvimento. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Biologia do Desenvolvimento. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer’s solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
