Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Las neuronas del sistema nervioso central adulto (SNC) tienen una capacidad regenerativa limitada después de una lesión o enfermedad. Una estrategia común para promover la regeneración del SNC es el trasplante, en el sitio de lesiones, de tipos celulares que inducen el crecimiento axonal como células madre, células Schwann, astrocitos o células olfativas de glia (OEG)^1,2,3,4,5.

OEG deriva de la cresta neural⁶ y se encuentra en la mucosa olfativa y en la bombilla olfativa. En el adulto, las neuronas sensoriales olfativas mueren regularmente como resultado de la exposición ambiental y son reemplazadas por neuronas recientemente diferenciadas. OEG rodea y guía estos nuevos axones olfativos para entrar en la bombilla olfativa y establecer nuevas sinapsis con sus objetivos en el CNS^7. Debido a estos atributos fisiológicos, OEG se ha utilizado en modelos de lesión del SNC como lesión de la médula espinal o del nervio óptico y sus propiedades neurorregenerativas y neuroprotectoras se convierten en probadas^8,9,10,11. Varios factores han sido identificados como responsables de las características pro-regenerativas de estas células, incluyendo la producción de proteasas de matriz extracelular o la secreción de factores de crecimiento neurotróficos y axoales^12,13,14.

Dadas las limitaciones técnicas para ampliar las células OEG primarias, previamente establecimos y caracterizamos líneas clonales OEG humanas inmortalizadas reversibles (ihOEG), que proporcionan un suministro ilimitado de OEG homogéneo. Estas células ihOEG derivan de cultivos primarios, preparados a partir de bombillas olfativas obtenidas en autopsias. Fueron inmortalizados por la transducción de la subunidad catalítica de telomerasa (TERT) y el oncogeno Bmi-1 y modificados con el antígeno T grande del virus SV40^15,16,17,18. Dos de estas líneas celulares ihOEG son Ts14, que mantiene la capacidad regenerativa de las culturas originales y Ts12, una línea regenerativa baja que se utiliza como un control de baja regeneración en estos experimentos^18.

Para evaluar la capacidad de OEG para fomentar la regeneración axonal después de una lesión neuronal, se han implementado varios modelos in vitro. En estos modelos, la OEG se aplica a cultivos de diferente origen neuronal y se afirma la formación y elongación de neuritas, en respuesta a la cocultura glial. Ejemplos de tales fuentes neuronales son las neuronas corticales de rata neonatal^19,heridas de arañazos realizadas en neuronas embrionarias de rata del tejido cortical^20,explantas retinianas de rata^21,neuronas posnatales hipotalales o hipocampales de rata^22,23, post Rata dorsal raíz dorsal neuronas^24,corticospoinal ratón postnatal neuronas del tracto corticospinal^25,neuronas NT2 humanas^26,o neuronas corticales cerebrales postnatal en cultivos reactivos similares a cicatrices de astrocitos²⁷.

En estos modelos, sin embargo, el ensayo de regeneración se basa en neuronas embrionarias o postnatales, que tienen una plasticidad intrínsefica que está ausente en las neuronas adultas lesionadas. Para superar este inconveniente, presentamos un modelo de regeneración axonal adulta en coculturas de líneas OEG con neuronas ganglionas retinales adultas (RGNs), basada en la desarrollada originalmente por Wigley et al.^28,29,30,31 y modificada y utilizada por nuestro grupo^{12,13,14,15,16,17,18,32,33.} Brevemente, el tejido retiniano se extrae de ratas adultas y se digiere con papaína. A continuación, la suspensión de células retinianas se coloca en los cubrecochetas tratados con poli lisina o en las monocapas Ts14 y Ts12. Los cultivos se mantienen durante 96 h antes de que se arreglen y luego se realiza inmunofluorescencia para las proteínas axonal (MAP1B y NF-H)³⁴ y somatodendritica (MAP2A y B)³⁵ marcadores. La regeneración axonal se cuantifica como un porcentaje de neuronas con axón, con respecto a la población total de RGNs y el índice de regeneración axonal se calcula como la longitud axonal media por neurona. Este protocolo no sólo es útil para evaluar el potencial neurorregenerativo de ihOEG, sino que se puede extender a diferentes fuentes de OEG u otras células gliales.