Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Les neurones du système nerveux central adulte (SNC) ont une capacité de régénération limitée après une blessure ou une maladie. Une stratégie commune pour favoriser la régénération de CNS est la transplantation, au site de blessure, des types de cellules qui induisent la croissance axonale telle que des cellules souches, des cellules de Schwann, des astrocytes ou des cellules olfactives d’ensheathing glia (OEG)^1,2,3,4,5.

OEG dérive de la crête^{neurale 6 et} se trouve dans la muqueuse olfactive et dans le bulbe olfactif. Chez l’adulte, les neurones sensoriels olfactifs meurent régulièrement à la suite de l’exposition à l’environnement et ils sont remplacés par des neurones nouvellement différenciés. OEG entoure et guide ces nouveaux axones olfactifs pour entrer dans l’ampoule olfactive et établir de nouvelles synapses avec leurs cibles dans le CNS⁷. En raison de ces attributs physiologiques, OEG a été employé dans des modèles des dommages de CNS tels que la moelle épinière ou la lésion de nerf optique et ses propriétés neuroregénératives et neuroprotective deviennent^{prouvées 8,9,10,11.} Plusieurs facteurs ont été identifiés comme responsables des caractéristiques pro-régénératrices de ces cellules, y compris la production extracellulaire de protéases de matrice ou la sécrétion des facteurs neurotrophiques et axonals^{de croissance 12,13,14.}

Compte tenu des limitations techniques pour étendre les cellules OEG primaires, nous avons précédemment établi et caractérisé réversible immortalisé oeg humain (ihOEG) lignes clonales, qui fournissent un approvisionnement illimité d’OEG homogène. Ces cellules ihOEG proviennent de cultures primaires, préparées à partir d’ampoules olfactives obtenues lors d’autopsies. Ils ont été immortalisés par transduction de la sous-unité catalytique de télomérase (TERT) et de l’oncogène Bmi-1 et modifiés avec le virus SV40 grand antigène T^15,16,17,18. Deux de ces lignées cellulaires ihOEG sont Ts14, qui maintient la capacité régénératrice des cultures originales et Ts12, une ligne régénérative faible qui est utilisée comme un faible contrôle de régénération dans ces expériences¹⁸.

Pour évaluer la capacité d’OEG à favoriser la régénération axonale après des dommages neuronaux, plusieurs modèles in vitro ont été mis en œuvre. Dans ces modèles, l’OEG est appliqué aux cultures d’origine neuronale différente et la formation et l’allongement de neurite- en réponse à la coculture gliale- sont assayed. Des exemples de telles sources neuronales sont les neurones corticals néonatals de rat^19,les blessures d’éraflure exécutées sur les neurones embryonnaires de rat du tissu cortical^20,les explants rétiniens de rat^21,les neurones postnatals hypothalamiques ou hippocampal de rat^22,23, neurones postnatals de ganglion de racine dorsale de rat^24,neurones corticospinal postnatals de région de souris^25,neurones humains de NT2^26,ou neurones corticals cérébraux postnatals sur les cultures réactives de cicatrice d’astrocyte^27.

Dans ces modèles, cependant, l’analyse de régénération repose sur des neurones embryonnaires ou postnatals, qui ont une plasticité intrinsèque qui est absente dans les neurones adultes blessés. Pour surmonter cet inconvénient, nous présentons un modèle de régénération axonale adulte dans les cocultures de lignées OEG avec des neurones ganglionaux rétiniens adultes (RRG), basé sur celui développé à l’origine par Wigley et coll.^28,29,30,31 et modifié et utilisé par notre groupe^{12,13,14,15,16,17,18,32,33}. En bref, le tissu rétinien est extrait de rats adultes et digéré avec de la papaïne. La suspension cellulaire rétinienne est ensuite plaquée sur des couvre-plaques traités à la polylysine ou sur des monocouches Ts14 et Ts12. Les cultures sont maintenues pendant 96 h avant d’être fixées, puis l’immunofluorescence pour les protéines axonales (protéines MAP1B et NF-H)³⁴ et les marqueurs somatodendritiques (MAP2A et B)³⁵ sont effectués. La régénération axonale est quantifiée en pourcentage des neurones avec l’axone, en ce qui concerne la population totale de RRG et l’indice de régénération axonale est calculée comme la longueur axonale moyenne par neurone. Ce protocole est non seulement utile pour évaluer le potentiel neurorégénératif de l’ihOEG, mais peut être étendu à différentes sources d’OEG ou d’autres cellules gliales.