Кокультура аксотомизированных Крысиных Нейронов Сетчатки Ganglion с обонятельной Энситинг Глиа, как в пробирке Модель регенерации взрослых аксональных
Summary
Мы представляем модель in vitro для оценки обонятельной энглии (OEG) нейрорегенеративной способности, после нервной травмы. Он основан на кокультуре аксотомизированных взрослых нейронов ганглия сетчатки (RGN) на монослойных OEG и последующем изучении аксональной регенерации, путем анализа RGN аксональных и соматодендритических маркеров.
Abstract
Обонятельные клетки оболочки глии (OEG) локализованы на всем пути от обонятельной слизистой оболочки до обонятельного нервного слоя (ONL) обонятельной луковицы. На протяжении всей взрослой жизни, они являются ключевыми для аксонального выращивания вновь созданных обонятельных нейронов, от ламины проприии в ONL. Из-за их про-регенеративных свойств, эти клетки были использованы для содействия аксональной регенерации в спинном мозге или оптических моделей травмы нерва.
Мы представляем модель in vitro для анализа и измерения нейрорегенеративной способности OEG после повреждения нервной системы. В этой модели, обратимо увековечены человека OEG (ihOEG) культурируется как монослой, сетчатки извлекаются из взрослых крыс и сетчатки ганглия нейронов (RGN) являются совместной культурой на OEG монослой. После 96 ч, аксональные и соматодендритические маркеры в RGNs анализируются иммунофлюоресценции и количество RGNs с аксоном и средняя длина аксональной / нейрон количественно.
Этот протокол имеет преимущество перед другими анализами in vitro, которые полагаются на эмбриональные или постнатальные нейроны, что он оценивает нейрорегенеративные свойства OEG во взрослой ткани. Кроме того, он не только полезен для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но может быть распространен на различные источники OEG или других глиальных клеток.
Introduction
Взрослые нейроны центральной нервной системы (ЦНС) имеют ограниченную регенеративную способность после травмы или заболевания. Общей стратегией для содействия регенерации ЦНС является трансплантация, в месте травмы, типов клеток, которые вызывают аксональный рост,такиекак стволовые клетки, клетки Шванн, астроциты или обонятельные оболочки клеток глии (OEG) 1,2,3,4,5.
OEG происходит от нервного гребня6 и находится в обонятельной слизистой оболочке и в обонятельной лампе. У взрослых, обонятельные сенсорные нейроны умирают регулярно в результате воздействия окружающей среды, и они заменяются вновь дифференцированных нейронов. OEG окружает и направляет эти новые обонятельные аксоны, чтобы войти в обонятельную лампу и установить новые синапсы со своими целями в ЦНС7. Из-за этих физиологических атрибутов, OEG был использован в моделях травмы ЦНС, таких как повреждение спинного мозга или зрительного нерва и его нейрорегенеративных и нейропротекторныхсвойств стало доказано 8,9,10,11. Несколько факторов были определены как ответственные за про-регенеративные характеристики этих клеток, в том числе внеклеточной матрицы протеаз производства или секреции нейротрофических и аксональныхфакторов роста 12,13,14.
Учитывая технические ограничения на расширение первичных клеток OEG, мы ранее установили и охарактеризовали обратимые увековеченные человеческие клональные линии OEG (ihOEG), которые обеспечивают неограниченное количество однородных OEG. Эти клетки ihOEG происходят из первичных культур, приготовленных из обонятельных луковиц, полученных в результате аутопсии. Они были увековечены путем трансдукции теломеразы каталитического подразделения (TERT) и онкогена Имт-1 и модифицированы с вирусом SV40 большойантиген T 15,16,17,18. Две из этих линий клеток ihOEG являются Ts14, который поддерживает регенеративную способность оригинальных культур и Ts12, низкая регенеративная линия, которая используется в качестве низкого контроля регенерации в этихэкспериментах 18.
Для оценки способности OEG способствовать аксональной регенерации после повреждения нервной системы было реализовано несколько моделей in vitro. В этих моделях, OEG применяется к культурам различного нейронного происхождения и формирования нейрита и удлинения в ответ на глиальной кокультуры- являются анализ. Примерами таких нейронных источников являются неонатальные крысиные корковыенейроны 19, царапинные раны, выполняемые на крысиных эмбриональных нейронахиз корковой ткани 20,крысиныесетчатки explants 21, крыса гипоталамическая или гиппокампа послеродовыенейроны 22,23, послеродовой крысы спинной корень ганглиянейронов 24, послеродовой мыши кортикоспинальных нейроновтракта 25, человека NT2нейронов 26, или послеродовой мозговой корковых нейронов на реактивных астроцитов шрам-каккультуры 27.
В этих моделях, однако, анализ регенерации опирается на эмбриональные или постнатальные нейроны, которые имеют внутреннюю пластичность, которая отсутствует в поврежденных взрослых нейронов. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы представляем модель регенерации взрослых аксональных в кокультурах линий OEG со взрослыми нейронами ганглия сетчатки (RGNs), на основе того, который первоначально разработан Wigley et al.28,29,30,31 и изменен и использованнашей группой 12,13,14,15,16,17,18,32,33. Кратко, ткань сетчатки извлекается от взрослых крыс и усваивается с papain. Подвеска сетчатки клетки после этого покрывается на или polylysine-обработанных coverslips или на Ts14 и Ts12 monolayers. Культуры поддерживаются в течение 96 ч, прежде чем они фиксируются, а затем иммунофлуоресценции для аксональных (MAP1B и NF-Hбелков) 34 и соматодендритных (MAP2A и B)35 маркеров выполняется. Аксональная регенерация измеряется в процентах от нейронов с аксоном, по отношению к общей популяции RGNs и аксональный индекс регенерации рассчитывается как средняя аксональная длина на нейрон. Этот протокол не только полезен для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но может быть распространен на различные источники OEG или других глиальных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
OEG трансплантации в ЦНС травмы сайтов считается перспективным терапии травмы ЦНС из-за его составных про-нейрорегенеративныхсвойств 7,8,9. Однако, в зависимости от источника ткани – обонятельной слизистой оболочки (OM-OEG) по сравнению с о?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана проектом SAF2017-82736-C2-1-R от Ministerio de Ciencia e Innovaci’n до MTM-F и Фондом Франсиско де Витория до JS.
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
Referências
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neurociência. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neurociência. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
