Coculture av akkotomiserte rotte Retinal Ganglion nevroner med Olfactory Ensheathing Glia, som en In Vitro modell av voksen aksonal regenerering

Voksne sentralnervesystemet (CNS) nevroner har begrenset regenerativ kapasitet etter skade eller sykdom. En vanlig strategi for å fremme CNS regenerering er transplantasjon, på skadestedet, av celletyper som induserer aksonal vekst som stamceller, Schwann-celler, astrocytter eller olfaktoriske ensheathing glia (OEG)^{celler 1,2,3,4,5}.

OEG kommer fra nevrale crest⁶ og lokaliserer i olfaktorisk slimhinne og i olfactory pære. Hos voksne dør olfaktoriske sensoriske nevroner regelmessig som følge av miljøeksponering, og de erstattes av nylig differensierte nevroner. OEG omgir og guider disse nye olfaktoriske aksonene for å gå inn i olfaktorisk pære og å etablere nye synapser med sine mål i CNS⁷. På grunn av disse fysiologiske egenskapene har OEG blitt brukt i modeller av CNS-skade som ryggmarg eller optisk nerveskade og dens nevroregenerative og nevrobeskyttende egenskaper blir bevist^8,9,10,11. Flere faktorer har blitt identifisert som ansvarlig for de pro-regenerative egenskapene til disse cellene, inkludert ekstracellulær matrise proteaser produksjon eller sekresjon av nevrotrofiske og aksonale^{vekstfaktorer 12,13,14}.

Gitt de tekniske begrensningene for å utvide primære OEG-celler, har vi tidligere etablert og karakterisert reversibel udødeliggjort menneskelig OEG (ihOEG) kloniske linjer, som gir en ubegrenset tilførsel av homogen OEG. Disse ihOEG cellene stammer fra primære kulturer, utarbeidet av olfaktoriske pærer oppnådd i obduksjoner. De ble udødeliggjort ved transduksjon av telomerase katalytisk underenhet (TERT) og onkogen Bmi-1 og modifisert med SV40-viruset stort T antigen^15,16,17,18. To av disse ihOEG cellelinjer er Ts14, som opprettholder regenerativ kapasitet av de opprinnelige kulturer og Ts12, en lav regenerativ linje som brukes som en lav regenereringskontroll i disse eksperimentene¹⁸.

For å vurdere OEG kapasitet til å fremme aksonær regenerering etter nevrale skader, har flere in vitro-modeller blitt implementert. I disse modellene brukes OEG på kulturer av forskjellig nevronal opprinnelse og neurittdannelse og forlengelse – som svar på glialkokultur – analyseres. Eksempler på slike nevronale kilder er neonatal rottekortikale nevroner¹⁹, scratch sår utført på rotte embryonale nevroner fra kortikalt^{vev 20}, rotte retinal explants²¹, rotte hypothalamus eller hippocampal postnatal nevroner^22,23, postnatal rotte dorsal rot ganglion nevroner²⁴, postnatal mus kortikospinalkanal nevroner²⁵, menneskelige NT2 nevroner²⁶, eller postnatal cerebral kortikale nevroner på reaktiv astrocytt arr-lignende kulturer²⁷.

I disse modellene er regenereringsanalysen imidlertid avhengig av embryonale eller postnatale nevroner, som har en iboende plastisitet som er fraværende i skadede voksne nevroner. For å overvinne denne ulempen, vi presentere en modell av voksen aksonal regenerering i cocultures av OEG linjer med voksen retinal ganglion nevroner (RGNs), basert på den som opprinnelig ble utviklet av Wigley et al.^28,29,30,³¹ og modifisert og brukes av vår gruppe^{12,13,14,15,16,17,18,32,33}. Kort, retinal vev ekstraheres fra voksne rotter og fordøyd med papain. Retinal celle suspensjon er deretter belagt på enten polylysin-behandlet coverslips eller på Ts14 og Ts12 monolayers. Kulturer opprettholdes i 96 timer før de er faste og deretter immunofluorescence for aksonære (MAP1B og NF-H proteiner)³⁴ og somatodendritic (MAP2A og B)³⁵ markører utføres. Aksonal regenerering kvantifiseres som en prosentandel av nevroner med akson, med hensyn til den totale populasjonen av RGN-er og aksonær regenereringsindeks beregnes som gjennomsnittlig aksonal lengde per nevron. Denne protokollen er ikke bare nyttig for å vurdere det neuroregenerative potensialet til ihOEG, men kan utvides til forskjellige kilder til OEG eller andre glialceller.