JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Beyazlatılmış Sıçan Retinal Ganglion Nöronlarının Koku Alma Ensheathing Glia ile Birlikte, Yetişkin Aksonal Rejenerasyonun In Vitro Modeli Olarak

Published: November 02, 2020
doi:
10.3791/61863
, , , ,
1Facultad de CC Experimentales,Universidad Francisco de Vitoria, 2Dept. Biomedical and Biotechnological Sciences, Section of Physiology,University of Catania, 3Dept. Anatomía, Histología y Neurociencia, Facultad de Medicina,Universidad Autónoma de Madrid

Summary

Nöral yaralanmadan sonra koku alma glia (OEG) nörojeneratif kapasitesini değerlendirmek için bir in vitro model sunuyoruz. RGN aksonal ve somatodendritik belirteçleri analiz ederek, OEG monolayerleri üzerinde axotomized adult retinal ganglion nöronlarının (RGN) bir kokülatürüne ve daha sonra aksonal rejenerasyon çalışmasına dayanmaktadır.

Abstract

Koku alma ensheathing glia (OEG) hücreleri koku mukozasından koku alma ampulün koku sinir tabakasına (ONL) kadar lokalize edilir. Yetişkin yaşamı boyunca, lamina propria’dan ONL’ye kadar yeni üretilen koku nöronlarının aksonal büyümesi için anahtardırlar. Pro-rejeneratif özellikleri nedeniyle, bu hücreler omurilik veya optik sinir yaralanması modellerinde aksonal yenilenmeyi teşvik etmek için kullanılmıştır.

Nöral yaralanmadan sonra OEG nörojeneratif kapasitesini test etmek ve ölçmek için bir in vitro model sunuyoruz. Bu modelde, geri dönüşümlü olarak ölümsüzleştirilmiş insan OEG ‘i (ihOEG) monolayer olarak kültürlenir, retinalar yetişkin sıçanlardan çıkarılır ve retina ganglion nöronları (RGN) OEG monolayer üzerine kokültüre edilir. 96 saat sonra RGN’lerdeki aksonal ve somatodendritik belirteçler immünofluoresans ile analiz edilir ve aksonlu RGN sayısı ve ortalama aksonal uzunluk/nöron ölçülür.

Bu protokol, embriyonik veya postnatal nöronlara dayanan diğer in vitro testlere göre avantaja sahiptir, yetişkin dokusundaki OEG nörorejeneratif özelliklerini değerlendirir. Ayrıca, sadece ihOEG’nin nörorejeneratif potansiyelini değerlendirmek için yararlı değildir, aynı zamanda farklı OEG kaynaklarına veya diğer glial hücrelere de genişletilebilir.

Introduction

Erişkin merkezi sinir sistemi (CNS) nöronları yaralanma veya hastalıktan sonra sınırlı rejeneratif kapasiteye sahiptir. CNS rejenerasyonunu teşvik etmek için yaygın bir strateji, yaralanma bölgesinde, kök hücreler, Schwann hücreleri, astrositler veya koku ensheathing glia (OEG) hücreleri 1,2 ,3,4,5gibi aksonal büyümeye nedenolanhücre türlerininnaklidir.

OEG, nöral kret6’dan türemiştir ve koku mukozasında ve koku ampulünde bulunur. Erişkinlerde koku duyusal nöronlar çevresel maruziyet sonucu düzenli olarak ölürler ve yeni farklılaşmış nöronlarla değiştirilirler. OEG, bu yeni koku aksonlarını koku ampulüne girmek ve CNS7’dekihedefleriyle yeni sinapslar oluşturmak için çevreler veyönlendirir. Bu fizyolojik özellikler nedeniyle, OEG omurilik veya optik sinir hasarı gibi CNS yaralanma modellerinde kullanılmıştır ve nörorejeneratif ve nöroprotektif özellikleri kanıtlanmış hale gelmiştir8,9,10,11. Nörotrofik ve aksonal büyüme faktörlerinin hücre dışı matris proteaz üretimi veya salgılanması da dahil olmak üzere bu hücrelerin pro-rejeneratif özelliklerinden sorumlu olarak çeşitli faktörler tanımlanmıştır12,13,14.

Birincil OEG hücrelerini genişletmek için teknik sınırlamalar göz önüne alındığında, daha önce sınırsız homojen OEG kaynağı sağlayan geri dönüşümlü ölümsüzleştirilmiş insan OEG (ihOEG) klonal hatlarını kurduk ve karakterize ettik. Bu ihOEG hücreleri, otopsilerde elde edilen koku ampullerinden hazırlanan birincil kültürlerden türemiştir. Telomeraz katalitik alt ünlem (TERT) ve onkogen Bmi-1’in transdüksiyonu ile ölümsüzleştirildiler ve SV40 virüs büyük T antijeni15 , 16,17,18ile değiştirildiler. Bu ihOEG hücre çizgilerinden ikisi, orijinal kültürlerin rejeneratif kapasitesini koruyan Ts14 ve bu deneylerde düşük rejenerasyon kontrolü olarak kullanılan düşük rejeneratif bir çizgi olanTs12 18.

Nöral yaralanmadan sonra aksonal yenilenmeyi teşvik etmek için OEG kapasitesini değerlendirmek için çeşitli in vitro modeller uygulanmıştır. Bu modellerde, OEG farklı nöronal kökenli kültürlere uygulanır ve glial kokültüre yanıt olarak neurit oluşumu ve uzaması test edilir. Bu tür nöronal kaynaklara örnek olarak yenidoğan sıçan kortikal nöronları19, kortikal dokudan sıçan embriyonik nöronlarına yapılan çizik yaraları20, sıçan retina eksplantları21, sıçan hipotalamik veya hipokampal postnatal nöronlar22 , 2223, postnatal sıçan dorsal kök ganglion nöronları24, postnatal fare kortikospinal sistem nöronları25, insan NT2 nöronları26veya reaktif astrosit skar benzeri kültürler üzerinde postnatal serebral kortikal nöronlar27.

Bununla birlikte, bu modellerde, rejenerasyon testi, yaralı yetişkin nöronlarında bulunmayan içsel bir plastisiteye sahip embriyonik veya postnatal nöronlara dayanır. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, başlangıçta Wigley ve arkadaşları tarafından geliştirilene dayanan yetişkin retinal ganglion nöronları (RGN’ ler) ile OEG çizgilerinin kokültürlerinde yetişkin aksonal rejenerasyon modelini sunuyoruz.28,29,30,31 ve modifiye ve grubumuz tarafından kullanılan12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kısaca, retina dokusu yetişkin sıçanlardan çıkarılır ve papain ile sindirilir. Retina hücre süspansiyonu daha sonra polilizin işlem görmüş kapak altlıklarına veya Ts14 ve Ts12 monolayerlere kaplanır. Kültürler sabitlenmeden önce 96 saat korunur ve daha sonra aksonal (MAP1B ve NF-H proteinleri)34 ve somatodendritik (MAP2A ve B)35 belirteçler için immünofluoresans yapılır. Aksonal rejenerasyon, RGN’lerin toplam popülasyonu ile ilgili olarak aksonlu nöronların yüzdesi olarak ölçülür ve aksonal rejenerasyon indeksi nöron başına ortalama aksonal uzunluk olarak hesaplanır. Bu protokol sadece ihOEG’nin nörorejeneratif potansiyelini değerlendirmek için yararlı olmakla kalmaz, aynı zamanda farklı OEG kaynaklarına veya diğer glial hücrelere de genişletilebilir.

Protocol

NOT: Hayvan deneyleri ulusal ve kurumsal biyoetik komiteleri tarafından onaylanmıştır. 1. ihOEG (Ts12 ve Ts14) kültürü NOT: Bu işlem doku kültürü biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılır. Tablo 1’de belirtildiği gibi 50 mL ME10 OEG kültür ortamı hazırlayın. Tablo 1’de belirtildiği gibi 15 mL konik tüpte 5mL DMEM/F12-FBS hazırlayın. Her iki ortamı da 37 °C’de temiz bir …

Representative Results

Bu protokolde nöronal yaralanma sonrası OEG nörojeneratif kapasitesini test etmek için bir in vitro model sunuyoruz. Şekil 1’degösterildiği gibi, OEG kaynağı, otopsilerde elde edilen koku ampullerinden hazırlanan birincil kültürlerden türeyen -Ts14 ve Ts12- ters çevrilebilir ölümsüzleştirilmiş bir insan OEG klonal hücre hattıdır15,17,18. Retina dokusu yetişkin sıçanlardan ç…

Discussion

CNS yaralanma bölgelerinde OEG transplantasyonu,7,8,9konstive pro-nörorejeneratif özellikleri nedeniyle CNS yaralanması için umut verici bir tedavi olarak kabul edilir. Bununla birlikte, doku kaynağına (koku mukozası (OM-OEG) ve koku ampulü (OB-OEG) veya donörün yaşına bağlı olarak,26, 31,33,36kapasitede önemli farklılıklar vardır…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Bakanio de Ciencia e Innovación’dan MTM-F’ye ve Fundación Universidad Francisco de Vitoria’dan JS’ye SAF2017-82736-C2-1-R projesi tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Materials

antibody 514 Reference 34 Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31 BioLegend 801601 Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody ThermoFisher A-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody ThermoFisher A-21207
B-27 Supplement Gibco 17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid Sigma 283967 NMDA receptor inhibitor
DAPI Sigma D9542 Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12 Gibco 11320033 Cell culture medium
FBS Gibco 11573397 Fetal bovine serum
FBS-Hyclone Fisher Scientific 16291082 Fetal bovine serum
Fluoromount Southern Biotech 0100-01 Mounting medium
ImageJ National Institutes of Health (NIH-USA) Image software
L-Glutamine Lonza BE17-605F
Neurobasal Medium Gibco 21103049 Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 For use in neural cell isolation
PBS Home made
PBS-EDTA Lonza H3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E Bacteriostatic and bactericidal
Pituitary extract Gibco 13028014 Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL) Sigma A-003-M
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
  2. Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
  3. Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
  4. Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
  5. Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
  6. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
  7. Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
  8. Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
  9. Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
  10. Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
  11. Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
  12. Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
  13. Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
  14. Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
  15. Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
  16. García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
  17. García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
  18. Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
  19. Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neurociência. 125 (3), 591-604 (2004).
  20. Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
  21. Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
  22. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
  23. Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
  24. Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
  25. Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
  26. Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
  27. Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
  28. Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
  29. Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
  30. Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
  31. Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
  32. Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
  33. García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
  34. Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
  35. Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neurociência. 87 (4), 861-870 (1998).
  36. Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).

Tags

Keywords: AxotomizedRetinal Ganglion NeuronsOlfactory Ensheathing GliaIn VitroAxonal RegenerationCocultureQuantitative TechniqueCell TherapyNervous System InjuriesRetinal DissectionPapainDNaseCentrifugationOvo Mucoid Protease InhibitorNB-B27 MediumPLL-treated CoverslipsOEG Monolayer
check_url/pt/61863?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Portela-Lomba, M., Simón, D., Russo, C., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration. J. Vis. Exp. (165), e61863, doi:10.3791/61863 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image