Denna artikel syftar till att beskriva ett systematiskt protokoll för att erhålla horisontella hippocampal hjärnskivor hos möss. Syftet med denna metodik är att bevara integriteten hos hippocampal fibervägar, såsom perforantvägen och det mossiga fiberområdet för att bedöma dentate gyrus relaterade neurologiska processer.
Hippocampus är en mycket organiserad struktur i hjärnan som är en del av det limbiska systemet och är involverad i minnesbildning och konsolidering samt manifestationen av allvarliga hjärnsjukdomar, inklusive Alzheimers sjukdom och epilepsi. Hippocampus får en hög grad av intra- och inter-connectivity, vilket säkerställer en korrekt kommunikation med interna och externa hjärnstrukturer. Denna anslutning uppnås via olika informationsflöden i form av fibervägar. Hjärnskivor är en ofta använd metodik när man utforskar neurofysiologiska funktioner i hippocampus. Hippocampal hjärnskivor kan användas för flera olika tillämpningar, inklusive elektrofysiologiska inspelningar, lätta mikroskopiska mätningar samt flera molekylärbiologiska och histokemiska tekniker. Därför representerar hjärnskivor ett idealiskt modellsystem för att bedöma proteinfunktioner, för att undersöka patofysiologiska processer som är involverade i neurologiska sjukdomar såväl som för läkemedelsupptäcktsändamål.
Det finns flera olika sätt att skära preparat. Hjärnskiva preparat med en vibratome möjliggör ett bättre bevarande av vävnadsstrukturen och garanterar en tillräcklig syretillförsel under skivning, vilket ger fördelar jämfört med traditionell användning av en vävnadshacker. Dessutom kan olika skärplan appliceras för vibratome hjärnsegmentpreparat. Här finns ett detaljerat protokoll för en lyckad beredning av vibratome-skuren horisontell hippocampal skivor av mushjärnor. I motsats till andra skiva preparat, horisontell skivning gör det möjligt att hålla fibrerna i hippocampal input path (perforant väg) i ett helt intakt tillstånd inom en skiva, vilket underlättar undersökningen av entorhinal-hippocampal interaktioner. Här ger vi ett grundligt protokoll för dissekering, extraktion och akut horisontell skivning av murinhjärnan och diskuterar utmaningar och potentiella fallgropar av denna teknik. Slutligen kommer vi att visa några exempel för användning av hjärnskivor i ytterligare applikationer.
Den omfattande utforskningen av hippocampus började när Scoville och Milner rapporterade oförmågan hos en patient (H.M.) att bilda nytt, deklarativt minne efter kirurgiskt avlägsnande av hippocampus och närliggande temporala lob strukturer som en behandling för svår epilepsi1. Från det ögonblicket har hippocampus studerats omfattande från allmänna neuronala egenskaper och funktioner fram till utvecklingen av allvarliga hjärnsjukdomar, såsom epilepsi och Alzheimers sjukdom2,3,4,5. Hippocampus är en del av det limbiska systemet, bestående av en grupp relaterade hjärnstrukturer involverade i känslor och minnesbildning6,7. Ett tätt nätverk av flera fibervägar utför en snäv hippocampal anslutning till inre och externa hjärnstrukturer. Dessa vägar inkluderar den mediala och laterala perforantvägen (entorhinal cortex för att dentate gyrus, CA3 – CA1 och subiculum)8, den mossiga fibervägen (dentate gyrus till CA3)9 och Schaffer säkerhet / associationskommissural väg (CA3 till CA1)10 (Figur 1). Hippocampus presenterar ett av de mest utforskade hjärnområdena hittills på grund av dess mycket bevarade laminära organisation av den neuronala lagerbildningen och möjligheten att få vitala neuronala kulturer och hjärnskivor med relativlätthet 5.
Figur 1: Tecknad film som illustrerar de olika hippocampalregionerna och de viktigaste fibervägarna. De olika hippocampal regionerna indikeras av fasta färgade linjer: entorhinal cortex (EG; svart), dentate gyrus (DG; orange), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (gul) och 1 (magenta) och subiculum (grön). Fiberbanor visas med en färgad prickad linje: den mediala (MPP, röd) och laterala perforantbanan (LPP, blå) (från entorhinal cortex till dentate gyrus, CA3, CA1 och subiculum), den mossiga fibervägen (MF, violett) (från dentate gyrus till CA3) och Schaffer säkerheter (SC, brun) (ipsilateral från CA3 till CA1)/associationella commissural vägar (AC, ljusgrön) (kontralateral från CA3 till CA1). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Brain slice protokoll resulterar ofta i förlust av anslutningar från mer avlägsna hjärnområden till området av intresse5. Dessutom är kapillärerna inte längre funktionella5 och blodcirkulationen berövas11. Trots dessa begränsningar används hjärnskivor fortfarande främst för undersökning av neurofysiologiska funktioner i hippocampus på grund av ett antal fördelar. För det första är extraktionen av hippocampussnabb 12 och kräver inte många material. De enda väsentliga instrumenten inkluderar en dissekeringssats, ett laboratorievattenbad, tillgång till karbin och en vibrerande mikrotom (vibratome)13. Andra tillgångar i hjärnsegmenttekniken är kringgåendet av blod- hjärnbarriären (BBB) och utsvöningen av endogent frisläppta molekyler före början avexperimentet 5, vilket gör det möjligt att studera effekten av läkemedel med relativt exakt doseringskontroll14. Dessutom bevarar hjärnskivor cytoarkitekturen och synaptiska kretsarna inom hippocampus15,16, där neuroanatomin och den lokala miljön med neuronal anslutning och komplexa neuron-glia interaktioner bevaras4,11,17. Dessutom är hippocampal fiberanslutningar främst enkelriktade och hippocampala nervceller har en hög synaptisk plasticitet, vilket oerhört förenklar insamlingen och tolkningen av högkvalitativa elektrofysiologiska inspelningar för att förstå neurologiska processer18,19. Viktigt är att hjärnskivor utgör en värdefull tillgång som är tillämplig i ett brett spektrum av olika vetenskapliga tekniker, som sträcker sig från molekylärbiologiska tekniker över bildinspelningar upp till elektrofysiologiskamätningar 12,20,21,22,23,24,25,26.
Som beskrivits ovan presenterar hippocampal hjärnskivor ett kraftfullt experimentellt verktyg för att studera strukturella och funktionella funktioner i den synaptiska anslutningen. Detta ger möjlighet att bedöma effekterna av kemikalier eller mutationer på neuronal excitabilitet och plasticitet16.
Akuta hjärnsnittspreparat presenterar en relativt känslig teknik och optimal skiva kvalitet är mycket beroende av idealiska experimentella tillstånd, inklusive djurets ålder, dödshjälpsmetoden, dissekeringshastigheten och skivningen, skivningslösningarna och parametrarna (t.ex. skivningshastighet) samt villkoren för skivaåterhämtning 4. Därför är ett väl utformat protokoll av yttersta vikt och säkerställer reproducerbarheten mellan olika forskningsenheter13.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för akuta horisontella hippocampal slice preparat, med målet att bevara integriteten hos hippocampal laterala och mediala perforant väg och mossiga fibervägen, vilket möjliggör undersökning av dentate gyrus relaterade processer9. Vi kommer att beskriva i detalj de viktigaste stegen för att dissekera, extrahera och horisontellt skära murin hjärnan, följt av representativa resultat av kalcium-mikrofluorimetric inspelningar och fält excitatoriska postsynaptic potentiella inspelningar (fEPSPs) under baslinje förhållanden och under LTP induktion protokoll i hjärnan skivor av vilda typ C57BL/6J möss.
Även om det ofta används bland neurovetenskapsgemenskapen, står hjärnans skärpreparat också inför flera nackdelar. Till exempel är ingångs- och utgångsanslutningar till hjärnans intresseområden inte längre anslutna i en hjärnskiva. Dessutom, när den är isolerad, börjar vävnaden försämras långsamt med tiden och denna process kan förändra de fysiologiska förhållandena i hjärnskivan. Detta ämne i synnerhet är mycket oroande eftersom de flesta hjärnskiva inspelningar tar flera minuter till timmar, vilket resulterar i långa experimentella dagar med inspelningar som utförs på vävnad som isolerades upp till 6-8 h före början av experimentet. Dessutom avbryts ryggmärgsvätskan och blodcirkulationen under skiva preparat, vilket kan leda till bristen på viktiga endogena föreningar i en hjärnskiva. Och mest uppenbart kan skivningsproceduren i sig orsaka mekaniska vävnadsskador som kan äventyra de erhållna resultaten. De faktiska fördelarna med hjärnsnittspreparat uppväger dock fortfarande deras nackdelar, varför de presenterar en högt värderad och anställd teknik inom neurovetenskaplig forskning.
Akuta hippocampal hjärnskivor presenterar en kraftfull och därför allmänt använd teknik för att undersöka neuronala processer från en molekylär nivå upp till komplexa hjärnkretsstudier. Detta är baserat på hippocampus idealiska neuroanatomi som lätt kan bevaras i en skiva förberedelse18. Följaktligen används hippocampal hjärnskivor i en mängd olika vetenskapliga forskningsprojekt, inklusive läkemedelsscreeningar17,studier av neuronala och synaptiska egenskaper involverade i kognitivafunktioner 40,41, och undersökningar av patologiska hjärnförhållanden14,42,43. Men ett brett spektrum av olika applikationer orsakar också ett brett spektrum av tillgängliga segmentberedningsprotokoll som kan skilja sig åt i olika parametrar, till exempel dissekeringsförhållanden och skärplansorientering, bland andra. Därför måste den exakta forskningsfrågan för ett vetenskapligt projekt fastställas för att välja ett lämpligt segmentberedningsprotokoll.
Vävnadshackern presenterar en av de äldsta använda teknikerna för att förbereda hippocampal hjärnskivor44,45. De stora fördelarna med denna beredningsmetod inkluderar den låga kostnaden för helikoptern och den snabba och enkla användningen46. Vävnadshelikoptrar orsakar dock mekanisk stress som resulterar i morfologiska förändringar och celldöd47. I jämförelse är vibratome en ganska dyr maskin och tiden för skärberedning ökar avsevärt vilket kan påverka skivaens kvalitet. Vibratome erbjuder dock vanligtvis ett mer skonsamt sätt att separera skivorna från vävnaden och gör det möjligt att hålla hjärnan snyggt kyld och syresatt under hela isoleringsproceduren, vilket förbättrarskäregenskaperna 46. Därför använder flera grupper standard denna teknik och har tidigaremat protokoll för beredning av akuta hippocampala hjärnskivor med vibratome16,30,48. Medan vissa protokoll bara ger några detaljer för själva skivningen men snarare fokuserar på en specifik tillämpning av sådanasegmentberedning 48, ger andra detaljerade segmentprotokoll som skiljer sig åt i skärplan eller andra protokolldetaljer (t.ex. agarose inbäddning eller segment / återställningslösningar) som ges iden här artikeln 27,30.
Protokollet som beskrivs här presenterar en enkel metod för att förbereda högkvalitativa akuta horisontella hippocampal mus hjärnskivor från unga djur. Protokollet är särskilt användbart för att bevara den perforantväg (mediala och laterala) som presenterar hippocampal ingångsvägen, som projicerar från entorhinal cortex till hippocampus8,49,50. Sagittal, koronal, liksom isolerade hippocampus tvärgående skiva preparat bevarar inte ordentligt perforantvägen, som härstammar från främst lager II och V av entorhinal cortex och projekterar till flera områden inom hippocampus18. På grund av den anatomiska positionering av entorhinal cortex i förhållande till hippocampus, horisontella hjärnskivor är en nödvändighet för att upprätthålla helt intakt perforant väg fibrer inom skiva förberedelse31. Dessutom bevarar horisontell skivning idealiskt de mossiga fibrerna som projicerar från dentate gyrus till CA3-neuronerna i hippocampus9,30,50. Därför är denna beredningsmetod av högt värde för studier som undersöker hippocampal input pathways och GD-relaterade processer. Dessutom tillåter detta protokoll en undersökning av Schaffers säkerhetsväg50. Sagittal och koronal hjärnskiva preparat används dock oftare när man undersöker CA3 till CA1 fiberprojektioner, förmodligen på grund av deras något snabbare förberedelsetid som kan öka chansen att få högkvalitativa skivor. Ändå presenterar horisontella hippocampal slice preparat ett kraftfullt forskningsverktyg eftersom det gör det möjligt att bevara och undersöka alla hippocampal fibervägar inom en skiva halvklotet. Detta kan vara särskilt användbart när kretssvar studeras, till exempel i multielektrodanalysinspelningar.
Ett stort problem vid beredning av hjärnskivor är korrekt bevarande av hjärnvävnaden. Detta uppnås genom flera kritiska steg i vårt protokoll, inklusive en snabb dissekering, kontinuerlig och tillräcklig syresättning och kylning av vävnaden och skyddet av hjärnvävnaden med hjälp av den skyddande skärmetoden med en lågnatrium, hög sackaros skivningslösning39,51. Trots det faktum att det protokoll som beskrivs här ger en framgångsgrad på cirka 90%, kan potentiellt ytterligare skyddsåtgärder krävas när man arbetar med vävnad som härrör från äldre eller genetiskt olika djur eller när man försöker bevara en specifik cellpopulation. Flera metoder rapporterades redan för att skydda känsliga hjärnvävnad preparat. Dessa metoder inkluderar användning av NMDG-baserade skivningslösningar för att minska natriumpermeationen52,användningen av höga magnesiumnivåer i skivningslösningen för att blockera NMDA-receptoraktivitet53, och långvarig användning av skyddslösningar även under återhämtningsperioden23. Alla dessa åtgärder kommer att leda till minskad excitotoxicitet. Dessutom används ofta en transkardiell perfusion med iskallt skyddande ACSF-lösningar och är nödvändig när man arbetar med äldre djur27.
Akuta hippocampala hjärnskivor är idealiska och används i stor utsträckning för elektrofysiologiska studier av skäl som de höga amplitudsignalerna som kan erhållas från en relativt tjock (300-500 μm) akut hjärnskiva, vilket garanterar en hög signal tillbrusförhållande 11. Standardiserade elektrofysiologiska tillämpningar inkluderar extracellulära fältinspelningar och intracellulära helcellsinspelningar i spännings- eller strömklämmaläge. För att förvärva elektrofysiologiska data av hög kvalitet är skivans hälsa av största vikt och kan garanteras genom att strikt följa det presenterade protokollet. Men eftersom segmentberedningar presenterar en mycket känslig teknik bör en kvalitetskontroll rutinmässigt inkluderas före början av varje experiment. Flera parametrar kan användas som kvalitetskontroll av segmentet och utvärderas standard via indatautgångskurvor och baslinje fEPSP- eller EPSC-inspelningar19. Det bör dock noteras att suboptimala elektrofysiologiska egenskaper kan uppstå från experimentella fel som elektrodpositionering, orientering eller till och med skada och inte bara representerar den beredda skivans hälsa. Därför är det lämpligt att utföra ytterligare kvalitetskontroller som enkel visualisering och bedömning av cellerna under ett 40x-mål eller en DAPI-kärna färgning. Sådana kvalitetskontroller kan användas för att bekräfta konstant segmenthälsa över flera segmentberedningssessioner.
Kalciummikrofluormetri presenterar en mindre vanlig teknik för att studera hippocampal hjärnskivor. Denna teknik är dock av ytterligare värde till de vanliga extracellulära och intracellulära elektrodinspelningarna, eftersom det gör det möjligt att visualisera och kvantifiera intracellulära kalciumflöden, som är av stor betydelse vid neuronal och synaptisk signalering. Förändringar i intracellulära kalciumkoncentrationer är involverade i neurotransmittor vesikelfrisättning, postsynaptisk potentiell generering, reglering av synaptisk plasticitet och axonal nervledning54,55,56. Som en illustration av denna teknik( Figur 4) använde vi oss av ett kommersiellt tillgängligt kalciumfärgämne. Obestridligt kan behandling av vävnadsskivor med kalciumfärgämnen ge svårigheter som en ökad experimentell tidsram samt ineffektiv belastning av lägre belägna neuronala celler. Variationer i denna teknik skulle dock kunna användas för att kringgå dessa tekniska utmaningar. Till exempel är det möjligt att kombinera kalciummätningar och patchklämmainspelningar i hippocampala skivor. På detta sätt kan ett kalciumfluorescerande färgämne laddas i en specifik cell genom patchpipetten, vilket möjliggör mätningar av kalciumdynamik i en specifik cell av intresse57. Alternativt kan genetiskt modifierade djur som uttrycker kalciumindikatorn GCaMP58, antingen i hela hjärnan eller drivs av en cellspecifik promotor, användas. Intressant nog kan hjärnvävnad från GCaMP-djur med en direkt länkare till ett protein av intresse ge möjligheter att bestämma det neuronala uttrycksmönstret eller undersöka inblandningen i kalciumgnistor och vågor.
Sammantaget ger vi riktlinjerna för framgångsrik förberedelse av friska och livskraftiga horisontella hippocampal hjärnskivor från möss för elektrofysiologiska och bildinspelningar. Denna metodik är mycket användbar för att komma åt neurologiska förändringar som uppstår i hjärnpatologier som beskrivs i dentate gyrus.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar elektrofysiologienheten vid VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research under överinseende av Dr. Keimpe Wierda och Prof. Dr. Joris De Wit för användningen av deras forskningsanläggningar. Dessutom tackar vi alla medlemmar i Laboratoriet för jonkanalforskning och Laboratoriet för endometrium, endometrios och reproduktiv medicin vid KU Leuven för deras hjälpsamma diskussioner och kommentarer.
Projektet har fått medel från Forskningsstiftelsen-Flandern (G.084515N och G.0B1819N till J.V.) och KU Leuvens forskningsråd (C1-finansiering C14/18/106 till J.V.). K.P. är en FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow och fick finansiering från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet (665501) med Forskningsstiftelsen Flandern (FWO) (12T0317N). K.H. är postdoktor vid Forskningsstiftelsen Flandern, Belgien (12U7918N).
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |