マウス脳の水平海馬スライス

この研究のためのすべての動物実験は、KUルーヴェン(ベルギー)(P021/2012)の倫理審査委員会によって承認されました。 1. 高スクローススライス溶液と人工脳脊髄液(ACSF)の調製 実験日の前に 実験室グレード1の水を含む10xスライスプレ溶液の1Lを調製(mM):25KCl、20 CaCl2、10MgSO 4、12.5 KH2PO4(表1)を使用する。リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、磁性攪拌機で常に攪拌しながら、800 mL H2Oであらかじめ充填されたビーカーに化学物質をゆっくりと混ぜ合わせます。溶液を4°Cまたは室温(RT)で保存してください。 実験日に 実験室グレード1タイプ水(mMで):125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1MgSO 4、1.25NaH2PO4、26NaHCO3、25グルコースを備えた1X ACSFの1 Lを調製する。蒸気圧オスマノメーターを使用して、305~315 mOsm(pH~ 7.55~7.6)の間の浸透圧を検証します。注:リン酸カルシウムの沈殿を防ぐために、磁性攪拌機で常に攪拌しながら、800 mLのH2Oであらかじめ充填されたビーカー内のすべての固体化学物質をゆっくりと混合します。MgSO4 とCaCl2 を最後に加え、1Mストック溶液から必要な量にゆっくりと滴下します。 7.3~7.4の間でpHを設定するために、カルボーゲンとRTで連続的に1x ACSF溶液を泡立てる。注: pH が少し高すぎる場合や低すぎる場合は、カーボジネーション強度の小さな調整で十分です。pHがカーボゲネーションで7.45より高い場合は、1 M NaH2PO4溶液の数滴を加えて調整してください。 25mLの10xスライス前溶液と(mM)の25mLを含むビーカーに1x高ショ糖スライス溶液の250mL(脳あたり)を調製する:252ショ糖、26NaHCO3、および10グルコース(表3)。オスモルラリティが 320~325 mOsm (pH ~ 7.55~7.6) の間であることを確認します。 高ショ糖スライス溶液をカルボーゲンで10~15分間泡立て、7.3~7.4の間でpHを制御します。注:pHがカーボキネーションで7.45より高い場合は、1 M KH2PO4 溶液の数滴を追加して調整してください。 ハイスクローススライス溶液を20~30分間、超冷凍庫(-80°C)に入れ、一部冷凍するまで保管してください。 2. 脳解剖のためのワークスペースの準備 高スクローススライス液の冷却中に、以下を準備する。 水浴を32°Cに温めます。 回復チャンバー(図2A)にカルボゲン化されたACSF溶液を充填し、チャンバーを水浴に入れます。回復チャンバーの主な ACSF ボトルと ACSF にカルボーゲンを継続的に塗布します。 動物を実験室に案内する。注:動物の年齢、性別、および緊張は、個々の実験者によって決定され、特定の研究の質問に依存する必要があります。しかし、動物のパラメータは、異なる実験日間の比較性を保証するために、1つの研究内で一定に保たれるべきである。このプロトコルは、2~6週の年齢でC57BL/6J雄マウスを使用するために設計されました。古い動物が使用される場合、急性のスライスの脳の健康を維持するために、スライスおよび回復溶液は、それに応じて4、27(例えば、NMDG+- ベース溶液23、28)に適応する必要があります。 麻酔室を準備します。 ティッシュペーパーをレイアウトし、 広い開口部(カットオープン)、氷で満たされた90ミリメートルの培養皿、冷たい文化皿の上にフィルターペーパーの正方形、切断のための強力なはさみ、解剖ハサミ、湾曲した鉗子、スパチュラ、35mm培養皿、細かいブラシ、ブレード、標本プレート(ビブラートメが付属)、スーパー接着剤、ピペットチップ、4本のストラップ ビブラートオームを設定する:まず、正しい設定(ブレード移動速度:0.08 mm /s、切削振幅:1.4mm、切削周波数:85Hz)のビブラートオームをプログラムし、スライスチャンバーにカルボーゲンラインを取り付けます。次に、スライスチャンバーをホルダーに入れ、スライスチャンバーを囲むホルダーに氷を充填し、ビブラートメにすべてを取り付けます。最後に、カミソリの刃をビブラート式ブレードホルダーに入れる(図2B)。 高スクロース溶液の凍結後、以下の手順を行う。 20~30分後、ハイスクローススライス溶液を-80°Cの超冷凍庫から取り出し、ビーカーを氷の上に置きます。 ハイスクロース溶液をベンチのビブラートームの隣に置き、部分的に凍結した溶液をヘラと混ぜて素敵なスラッシュを取得し、カルボーゲンで泡立ち始めます。 プラスチック製のパスツールピペットでハイスクローススライス溶液を取り上げ、冷たい90mm培養皿の上に正方形のフィルターペーパーを浸します。 35 mm培養皿(または脳全体を保存するのに適した同等の小さな容器)をハイスクローススライス溶液(脳全体を覆うのに十分)で最大75%充填し、残りの溶液でビーカーの隣に保管された氷の上の培養皿を冷却します。35mm培養皿での溶液をカルボゲネート。 3. マウス脳の解剖と位置決め 5%イオフルランで動物を麻酔します。足をつまんで麻酔の適切な深さを決定します。足の離脱反射は起こるべきではありません。 ティッシュペーパーで動物を移し、強いはさみまたは小さい動物のギロチンでそれを切り落とす。 頭皮を切り開くには解剖ハサミを使用してください。 矢状縫合に沿ってカルバリアを切り開き、嗅球を含む脳全体が見えるまで湾曲した鉗子の助けを借りてそれを取り除く。注:カルバリアや鉗子の鋭いエッジで脳を損傷しないように注意してください。 脳を慎重にすくい取るためにへらを使用してください(嗅球は取り付けられたままにする必要があります)。 冷やされた35mm培養皿で脳を移し、ACSFで満たされたパスツールピペットで脳を穏やかに洗浄することによって組織からすべての毛髪または血液粒子を取り除く(血液は脳組織29に対する細胞毒性効果を有する)。 冷蔵90mm培養皿の上に浸したろ紙にスパチュラの助けを借りて脳を移す(図2A)。 ブレードを使用して脳を半分に切断し、2つの半球を分離し、切断したばかりの内側側に両方の半球を配置します。 ブレードを使用して、後側部分を取り外します (5%~ 10%)各半球から脳の、平行な切断を伴い、2C(図)30を、脳の腹側を上向きに切り取り、切り取りたばかりの側に両半球を配置する。 標本の版の上にスーパー接着剤の滴を置き、両方の半球を収容するためにピペットの先端で適切に広がる。 フィルターペーパーストラップで腹側に触れて毛細血管力で1つの半球を拾い上げ、それによって組織を損傷しないようにフィルターペーパーストラップを使用してください。 別のフィルターペーパーストラップを使用して、脳の後側を慎重に半乾燥させてから、片面プレートの接着剤の上に後側を下にして半球を配置します。2 番目の半球でも同じ手順を繰り返します。注: 半球は、回転体プレート上のミラー状の水平位置に配置され、ロストラル側は外側を指し、尾側は真ん中に向き合う(しかし触れていない)必要があります。両半球の内側側はビブラートメブレードを向き、側面は実験者に向かう必要があります(図2D)。 スライスチャンバーに試料プレートを置き、迅速に、しかし慎重に、氷冷高ショ糖スライス溶液スラッシュでそれをカバーします。溶液が接着剤に触れるとすぐに、それは固まり、適切に標本プレートに半球を接着します。 半球が高ショ糖スライス溶液で適切に覆われていることを保証し、溶液がカルボーゲンで泡立っていることを確認します。注: 解剖手順全体は、できるだけ速く実行する必要があります。非常に長い間、酸素の供給なしに脳がとどまらないようにしてください。それは、高ショ糖スライス溶液スラッシュで切断から脳の水没まで約1〜1.5分しかかからず。これは、スライスの高品質を保証するために急性脳スライス調製のための最も重要な要件です。 4. 脳の水平スライス ビブラートメブレードを半球の内側側の前に置き、現在上向きになっている半球の腹側と同じ高さに下げます。ビブラートメコントロールの助けを借りてブレードを下げ、さらに600μmの後方方向に切り、スライスを開始します。ブレードは、組織に当たる必要があります(そうでなければ、ブレードを逆にしてもう少し下げます)。最初の 2 つのスライスが 2 つの半球から完全に分離されるまでスライスします。 ブレードを逆にして、さらに300μm下げて、もう一度スライスします。 海馬が見えるようになると(必要に応じて、マウス31 脳アトラスを使用して助けを求める)(図2E)は、拡大されたプラスチック製のパスツールピペットでスライスを収集する。海馬の隣に、ケーデートのプタメンが見えるまでスライスを集める。通常、マウスの脳のために300 μm(1半球あたり4~6)の8~12個のスライスを採取することができます。 プラスチック製のパスツールピペットを使用してスライスを収集し、水浴中の回収室(図2F)に移します(スライスの各ラウンド後にスライスを収集してスライスチャンバーに浮かびまないようにします)。注:できるだけ速く作業し、ハイスクローススライス溶液が氷冷と全体の手順の間にカルボゲン化されていることを確認してください。必要に応じて、スライスチャンバーを囲む氷を補充します。 5. 電気生理学的記録のための脳スライスの回復 32°Cの水浴でACSF充填回収室にスライスを1時間放置します。注:回復チャンバーも市販されています。 水浴から回復室を取り出します。 それ以上のアプリケーションを開始する前に、回復のために少なくとも別の30分間RTにスライスを置きます。 海馬の内側穿角経路(MPP)におけるfEPSP録音 ホウケイ酸ガラスキャピラリーからピペットを引き出し、水平ピペットプーラーでピペットを受け取り、ACSF溶液で充填し、ACSF充填記録チャンバに浸漬すると、〜2MΩの大きさのピペットを受け取ります。 記録チャンバに接続された重力制御多バレル灌流システムに適切な化学物質(例えば、Bicuculline)を含むACSF浴溶液およびACSF溶液を充填する。継続的にすべてのソリューションをカーボケート。 記録室の灌流ラインの反対側に接続された吸引管に接続された蠕動ポンプまたは真空ポンプをオンにします。ACSF 充填バレルを開き、連続的なフローの確立を開始します(1~ 2 ドロップ/秒)。参照電極が ACSF ソリューションに沈み込みされていることを確認します。 セットアップコンピュータ、アンプ、マイクロマニピュレータ、刺激装置、顕微鏡ライト、カメラ、モニタ(該当する場合)のスイッチをオンにします。 電気生理学的記録に適したソフトウェアを開きます(電気生理学的機器用のハードウェアおよびソフトウェアプロバイダが複数存在します)。 回復チャンバーからスライスセットアップの記録チャンバーに1つの脳スライス半球を移し、視野のデンテート回顆粒細胞層と分子層と正しい方向に配置します。刺激電極が内皮質の方向からスライス内のMPPに到達できること、および記録電極がCA3の方向から正反対の側からMPPにアクセスできることを確認してください。 クリップ(図3A)または市販の脳スライスグリッドで記録チャンバー内のスライスを安定化させます。注:スライスの転送と位置決めの間に、灌流をオフにすると便利です。しかし, これは脳のスライスの品質を保証するためにあまりにも長い時間を取るべきではありません.. MPP内の記録および刺激電極を、顆粒細胞層に近い分子層の下3分の1(図3B)に下げ、位置を設定し、約100~150μmの距離で互いに向き合う。刺激電極は表面に最小限に接触し、記録電極は上部スライス層にわずかに浸透するべきである。 fEPSP信号を得るために、脳スライスに低強度刺激(0.1msの30〜50 μA)を適用します。必要に応じて電極の位置を調整します(例えば、低いか、または非定型のfEPSP信号)。 入力出力曲線の記録を開始:30 sの間隔で脳スライスに増加する刺激強度を適用します。 刺激強度を最大fEPSP応答の50%に設定し、ベースラインfEPSPの録音を開始し、脳スライスに30秒間に20〜40分間の50%の刺激強度を適用します。 ベースラインが安定しているように見える場合は、追加の記録(例えば、LTP /LTDプロトコルおよび/または薬物アプリケーション)を進めてください。(MPPでのLTP誘導では、ここでは5分間隔で適用される4回1s 100Hzパルスからなるプロトコルが使用された。ビキュクリンは、コンディショニング段階の10分前および調整段階で適用した。注: すべての録音は、適切なローパスフィルタリング(10 kHz)を使用して、現在のクランプモードで実行する必要があります。 適切なファイル形式でデータを抽出し、ファイバー・ボレー、fEPSP 振幅、fEPSP スロープなどの fEPSP パラメーターを分析します。 7. 脳スライスのカルシウムイメージング記録 12ウェルチャンバーに1つの脳スライス半球を移し、適切なカルシウム染料で30分から1時間ロードします。12ウェルプレートの蓋に自作の穴(ホット18G針付き)を通してカルボゲネーションチューブを挿入することで、積載溶液を継続的にカーボゲネートします。注:このステップは、GCaMPなどの蛍光レポーターを内因的に発現する遺伝子組み換え動物からの脳スライス調製の場合には必要ありません。 手順 6.2 ~ 6.5 の説明に従って、録画のセットアップを準備します。メモ:マイクロフルメトリックイメージング実験には、アンプやマイクロマニピュレータは必要ありません。刺激装置の使用は実験に依存する。蛍光イメージング実験のための特定のソフトウェアが不可欠である。 正しいイメージング設定にソフトウェアを調整する:これには、カメラアンプとビニング設定、波長の設定、露光時間、タイミングプロトコルが含まれます。設定は正確な実験によって異なる場合があります。(トレース例としては、1 x 1 ビニング、2.4x プリアンプ ゲイン、300 EM カメラゲイン、488 nm で 50 ミリ秒の露光を実験の間 500 ミリ秒ごとに繰り返して使用しました。 カルシウム染料をロードした後、脳スライス半球を12ウェルから記録室に移し、顕微鏡ステージに置きます。 ペーパークリップ(図3A)またはステップ6.7に記載したものと同様の市販の脳スライスグリッドで記録チャンバー内のスライスを安定化させます。 対象領域が正しい顕微鏡分野に焦点を当てるようにしてください。 蛍光イメージングソフトウェアを使用して、スライス上の関心領域(ROI)を複数選択します。注:フォトブリーチによる明るさの一般的な変動に従うために、視野全体を選択すると便利です。 記録を開始し、選択した時点で実験用試験薬を適用します。注:各実験の最後に高いK+ 溶液を適用して、細胞の神経の特徴とスライスの品質を検証することをお勧めします。 適切なファイル形式でデータを抽出し、測定全体にわたってROIで発生する蛍光信号の変化を分析します。ROI は、オフライン解析中にも適合させることができます。注: 脳スライスにおけるfEPSP記録とカルシウムマイクロフルオリメトリーを記述する他のプロトコルは、文献24、32、33、34、35で利用可能です。