इस लेख का उद्देश्य चूहों में क्षैतिज हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। इस पद्धति का उद्देश्य हिप्पोकैम्पस फाइबर रास्तों की अखंडता को संरक्षित करना है, जैसे कि छिद्रपूर्ण पथ और काई फाइबर ट्रैक्ट डेंटेट जाइरस संबंधित न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं का आकलन करने के लिए।
हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क में एक अत्यधिक संगठित संरचना है जो लिम्बिक प्रणाली का एक हिस्सा है और स्मृति गठन और समेकन के साथ-साथ अल्जाइमर रोग और मिर्गी सहित गंभीर मस्तिष्क विकारों की अभिव्यक्ति में शामिल है। हिप्पोकैम्पस को उच्च स्तर की अंतर-और अंतर-कनेक्टिविटी प्राप्त होती है, जो आंतरिक और बाहरी मस्तिष्क संरचनाओं के साथ उचित संचार हासिल करती है। यह कनेक्टिविटी फाइबर रास्तों के रूप में विभिन्न सूचनात्मक प्रवाहों के माध्यम से पूरी की जाती है। हिप्पोकैम्पस के न्यूरोफिजियोलॉजिकल कार्यों की खोज करते समय मस्तिष्क स्लाइस अक्सर उपयोग की जाने वाली पद्धति होती है। हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग कई अलग-अलग अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, हल्के सूक्ष्म माप के साथ-साथ कई आणविक जैविक और हिस्टोकेमिकल तकनीक शामिल हैं। इसलिए, मस्तिष्क स्लाइस प्रोटीन कार्यों का आकलन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, न्यूरोलॉजिकल विकारों में शामिल रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं के साथ-साथ दवा खोज उद्देश्यों के लिए जांच करने के लिए।
स्लाइस तैयारी के कई अलग-अलग तरीके मौजूद हैं। वाइब्रेकोम के साथ मस्तिष्क स्लाइस तैयारी ऊतक संरचना के बेहतर संरक्षण की अनुमति देती है और टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान पर्याप्त ऑक्सीजन आपूर्ति की गारंटी देती है, जो ऊतक हेलिकॉप्टर के पारंपरिक उपयोग पर फायदे पेश करती है। इसके अलावा, वाइब्रेटम ब्रेन स्लाइस तैयारियों के लिए विभिन्न कटिंग प्लेन लगाए जा सकते हैं। यहां, माउस दिमाग के वाइब्रेटोम-कट क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस की सफल तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। अन्य स्लाइस तैयारी के विपरीत, क्षैतिज टुकड़ा एक टुकड़ा के भीतर पूरी तरह से बरकरार स्थिति में हिप्पोकैम्पल इनपुट पथ (छिद्रपूर्ण पथ) के फाइबर रखने की अनुमति देता है, जो एंटोराइनल-हिप्पोकैम्पल इंटरैक्शन की जांच की सुविधा प्रदान करता है। यहां, हम मुरीन मस्तिष्क के विच्छेदन, निष्कर्षण और तीव्र क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक पूरी तरह से प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और इस तकनीक की चुनौतियों और संभावित नुकसान पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम आगे के अनुप्रयोगों में मस्तिष्क स्लाइस के उपयोग के लिए कुछ उदाहरण दिखाएंगे।
हिप्पोकैम्पस की व्यापक खोज तब शुरू हुई जब स्कोविल और मिलनर ने गंभीर मिर्गी1के उपचार के रूप में हिप्पोकैम्पस और पास के लौकिक पालि संरचनाओं के सर्जिकल हटाने के बाद नई, घोषणात्मक स्मृति बनाने के लिए एक रोगी (एच.M.) की असमर्थता की सूचना दी। उस क्षण से, हिप्पोकैम्पस का बड़े पैमाने पर सामान्य न्यूरोनल गुणों से शुरू किया गया है और मिर्गी और अल्जाइमर रोग2, 3,4,5जैसे गंभीर मस्तिष्क विकारों के विकास तक कार्य करता है। हिप्पोकैम्पस लिम्बिक सिस्टम का हिस्सा है, जिसमें संबंधित मस्तिष्क संरचनाओं का एक समूह शामिल है जो भावना और स्मृति निर्माण6,7में शामिल है। कई फाइबर रास्तों का एक घना नेटवर्क आंतरिक और बाहरी मस्तिष्क संरचनाओं के लिए एक तंग हिप्पोकैम्पस कनेक्टिविटी को पूरा करता है। इन रास्तों में मध्यवर्ती और पार्श्व परफारॅ्मेट पाथ (एंटोराइनल कॉर्टेक्स टू डेंटेट जाइरस, सीए3 – सीए1 और सबिकुलम)8,मॉसी फाइबर पाथ (डेंटेट जायरस से सीए 3)9 और शेफर कोलैटरल/एसोसिएशनल कॉमिसरल पाथवे (सीए 3 से सीए1)10 (चित्रा 1)शामिल हैं। हिप्पोकैम्पस न्यूरोनल लेयर गठन के अत्यधिक संरक्षित लैमिनार संगठन के कारण अब तक सबसे मोटे तौर पर खोजे गए मस्तिष्क क्षेत्रों में से एक प्रस्तुत करता है, और सापेक्ष आसानी से महत्वपूर्ण न्यूरोनल संस्कृतियों और मस्तिष्क स्लाइस प्राप्त करने की संभावना5।
चित्रा 1: विभिन्न हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों और मुख्य फाइबर रास्तों को दर्शाते कार्टून। विभिन्न हिप्पोकैम्पस क्षेत्रों को ठोस रंगीन रेखाओं द्वारा इंगित किया जाता है: एंटोराइनल कॉर्टेक्स (ईसी; ब्लैक), डेंटेट जाइरस (डीजी; नारंगी), कॉर्नू अमोनिस (सीए) 3 (सियान), 2 (पीला), और 1 (मैजेंटा), और उपमूर्ति (हरा)। फाइबर रास्ते एक रंगीन बिंदीदार रेखा के साथ दिखाए जाते हैं: मध्यशास्त्री (एमपीपी, लाल) और पार्श्व छिद्र पथ (एलपीपी, नीला) (एंटोराइनल कॉर्टेक्स से डेंटेट जायरस, सीए 3, सीए 1, और सबिकुलम तक), मॉसी फाइबर पाथवे (एमएफ, वायलेट) (डेंटेट जाइरस से सीए 3 तक) और शेफर कोलैटरल (एससी, ब्राउन) (CA3 से CA1) /एसोसिएशनल कॉमिसुरल पाथवे (एसी, लाइट ग्रीन) (सीए 3 से सीए1 तक कॉन्ट्रालेट) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
ब्रेन स्लाइस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप अक्सर अधिक दूर के मस्तिष्क क्षेत्रों से ब्याज के क्षेत्र में कनेक्शन की हानि होती है5. इसके अलावा, केशिकाएं अब कार्यात्मक नहीं हैं5 और रक्त परिसंचरण11से वंचित है । इन सीमाओं के बावजूद, मस्तिष्क स्लाइस अभी भी मुख्य रूप से कई फायदों के कारण हिप्पोकैम्पस के न्यूरोफिजियोलॉजिकल कार्यों की जांच के लिए उपयोग किए जाते हैं। सबसे पहले, हिप्पोकैम्पस का निष्कर्षण तेजी से12 है और कई सामग्रियों की आवश्यकता नहीं है। केवल आवश्यक उपकरणों में एक विच्छेदन किट, एक प्रयोगशाला जल स्नान, कार्बोजन तक पहुंच और एक कंपन माइक्रोटोम (वाइब्रेटोम)13शामिल हैं। मस्तिष्क की स्लाइस तकनीक की अन्य संपत्तियां रक्त-मस्तिष्क-बाधा (बीबीबी) और प्रयोग5की शुरुआत से पहले अंतर्जात रूप से जारी अणुओं के धोने से दरकिनार हैं, जिससे अपेक्षाकृत सटीक खुराक नियंत्रण14के साथ दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करना संभव हो जाता है। इसके अलावा, मस्तिष्क के स्लाइस हिप्पोकैम्पस15, 16के भीतर साइटो-आर्किटेक्चर और सिनैप्टिक सर्किटको संरक्षितकरते हैं, जहां न्यूरोएनाटॉमी और न्यूरोनल कनेक्टिविटी और जटिल न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन के साथ स्थानीय वातावरण4,11,17 संरक्षितहैं। इसके अतिरिक्त, हिप्पोकैम्पल फाइबर कनेक्शन मुख्य रूप से एकदिशात्मक और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में एक उच्च सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी होती है, जो न्यूरोलॉजिकल प्रक्रियाओं को समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के संग्रह और व्याख्या को काफी सरल बनाता है18,19। महत्वपूर्ण बात यह है कि मस्तिष्क के स्लाइस विभिन्न वैज्ञानिक तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू एक मूल्यवान संपत्ति प्रस्तुत करते हैं, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकलमापन12, 20, 21, 22,23,24,25, 26तक इमेजिंग रिकॉर्डिंग पर आणविक जैविक तकनीकों से फैलेहोतेहैं।
जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस सिनैप्टिक कनेक्टिविटी की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक उपकरण प्रस्तुत करते हैं। यह न्यूरोनल उत्तेजना और प्लास्टिसिटीपररसायनों या उत्परिवर्तनों के प्रभावों का आकलन करने का अवसर प्रदान करता है ।
तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी एक अपेक्षाकृत संवेदनशील तकनीक पेश कर रहे हैं और इष्टतम टुकड़ा गुणवत्ता आदर्श प्रायोगिक स्थितियों पर अत्यधिक निर्भर है, जिसमें पशु की आयु, इच्छामृत्यु की विधि, विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया की गति, टुकड़ा करने की क्रिया समाधान और पैरामीटर (जैसे, टुकड़ा करने की गति) के साथ-साथ स्लाइस रिकवरी4के लिए शर्तें शामिल हैं। इसलिए, एक अच्छी तरह से डिजाइन प्रोटोकॉल का सबसे अधिक महत्व है और विभिन्न अनुसंधान इकाइयों में प्रजनन क्षमता को सुरक्षित करता है13।
यहां, हम तीव्र क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसका उद्देश्य हिप्पोकैम्पल पार्श्व और मध्यकालीन छिद्रण पथ और काई फाइबर मार्ग की अखंडता को संरक्षित करना है, जिससे डेंटेट जाइरस संबंधित प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति9। हम विस्तार से विच्छेदन, निकालने, और क्षैतिज मुरीन मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए महत्वपूर्ण कदम का वर्णन करेंगे, कैल्शियम के प्रतिनिधि परिणामों के बाद-microfluorimetric रिकॉर्डिंग और क्षेत्र उत्तेजक पोस्टसिनैप्टिक संभावित रिकॉर्डिंग (fEPSPs) आधारभूत परिस्थितियों के तहत और जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के मस्तिष्क स्लाइस में LTP प्रेरण प्रोटोकॉल के दौरान ।
हालांकि आमतौर पर तंत्रिका विज्ञान समुदाय के बीच उपयोग किया जाता है, मस्तिष्क स्लाइस तैयारी भी कई नुकसान के साथ सामना कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए इनपुट और आउटपुट कनेक्शन अब मस्तिष्क के टुकड़े में नहीं जुड़े होते हैं। इसके अलावा, एक बार अलग, ऊतक समय के साथ धीरे-धीरे अपमानजनक शुरू होता है और इस प्रक्रिया को मस्तिष्क टुकड़ा की शारीरिक स्थितियों को बदल सकता है। विशेष रूप से यह विषय बहुत संबंधित है क्योंकि अधिकांश मस्तिष्क स्लाइस रिकॉर्डिंग कई मिनट से घंटों तक ले रही है, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक प्रयोगात्मक दिनों में ऊतक पर प्रदर्शन किया जाता है जो प्रयोग की शुरुआत से पहले 6-8 घंटे तक अलग-थलग हो जाता था। इसके अलावा, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ और रक्त परिसंचरण स्लाइस तैयारी के दौरान बाधित हो जाते हैं, जिससे मस्तिष्क के टुकड़े के भीतर महत्वपूर्ण अंतर्जात यौगिकों की कमी हो सकती है। और सबसे स्पष्ट रूप से, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया ही यांत्रिक ऊतक क्षति है कि प्राप्त परिणामों से समझौता हो सकता है कारण हो सकता है । हालांकि, मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के वास्तविक लाभ अभी भी उनके नुकसान पल्ला झुकना है, यही वजह है कि वे तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक उच्च मूल्यवान और नियोजित तकनीक मौजूद हैं ।
तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस जटिल मस्तिष्क सर्किट अध्ययन करने के लिए एक आणविक स्तर से न्यूरोनल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली और इसलिए व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक मौजूद है। यह हिप्पोकैम्पस के आदर्श न्यूरोएनाटॉमी पर आधारित है जिसे स्लाइस तैयारी18में आसानी से संरक्षित किया जा सकता है। नतीजतन, हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क के स्लाइस का उपयोग विभिन्न प्रकार की वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजनाओं में किया जाता है, जिसमें दवा स्क्रीनिंग17,संज्ञानात्मक कार्यों में शामिल न्यूरोनल और सिनैप्टिक गुणों का अध्ययन40,41,और पैथोलॉजिकल मस्तिष्क की स्थिति14, 42,43की जांच शामिल है। हालांकि, विभिन्न अनुप्रयोगों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम भी उपलब्ध स्लाइस तैयारी प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बनता है जो विभिन्न मापदंडों में भिन्न हो सकते हैं, जैसे विच्छेदन की स्थिति और विमान अभिविन्यास को काटना। इसलिए, एक वैज्ञानिक परियोजना के सटीक अनुसंधान प्रश्न के लिए एक उपयुक्त टुकड़ा तैयारी प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए निर्धारित किया जाना है ।
टिश्यू हेलिकॉप्टर हिप्पोकैम्पल ब्रेन स्लाइस44,45तैयार करने के लिए सबसे पुरानी तकनीकों में से एक प्रस्तुत करता है । इस तैयारी विधि के प्रमुख फायदों में हेलिकॉप्टर की कम लागत और तेज और आसान उपयोगशामिलहैं । हालांकि, ऊतक हेलिकॉप्टर यांत्रिक तनाव का कारण बनते हैं जिसके परिणामस्वरूप रूपात्मक परिवर्तन और कोशिका मृत्यु47होती है। इसकी तुलना में, वाइब्रेकोम एक महंगी मशीन है और स्लाइस तैयार करने का समय काफी बढ़ जाता है जिसका टुकड़ा की गुणवत्ता पर प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, वाइब्रेटम आमतौर पर ऊतक से स्लाइस को अलग करने का एक अधिक सौम्य तरीका प्रदान करता है और मस्तिष्क को पूरी अलगाव प्रक्रिया पर अच्छी तरह से ठंडा और ऑक्सीजनयुक्त रखने की अनुमति देता है, जिससे स्लाइस गुणों में सुधार होता है46। इसलिए, कई समूह इस तकनीक को मानक रूप से नियोजित कर रहे हैं और वाइब्रेटोम16,30,48का उपयोग करके तीव्र हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल को आगे लाए हैं । जबकि कुछ प्रोटोकॉल टुकड़ा करने की क्रिया के लिए केवल कुछ विवरण प्रदान करते हैं, बल्कि इस तरह के टुकड़ा तैयारी४८के एक विशिष्ट आवेदन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, दूसरों को विस्तृत टुकड़ा प्रोटोकॉल है कि विमान या अंय प्रोटोकॉल विवरण (जैसे, agarose एम्बेडेड या टुकड़ा/वसूली समाधान) इस अनुच्छेद27,30में दिए गए काटने में अलग प्रदान करते हैं ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल युवा जानवरों से उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र क्षैतिज हिप्पोकैम्पस माउस मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए एक सीधी विधि प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल विशेष रूप से छिद्रपूर्ण पथ (मध्य और पार्श्व) को संरक्षित करने के लिए उपयोगी है जो हिप्पोकैम्पस इनपुट मार्ग प्रस्तुत करता है, जो एंटोराइनल कॉर्टेक्स से हिप्पोकैम्पस8,49,50तक प्रोजेक्ट करता है। धनु, कोरोनल, साथ ही अलग हिप्पोकैम्पस ट्रांसवर्स स्लाइस तैयारी ठीक से छिद्रपूर्ण पथ को संरक्षित नहीं करती है, जो मुख्य रूप से कीटोरिनल कॉर्टेक्स की परतों द्वितीय और वी से निकलती है और हिप्पोकैम्पस18के भीतर कई क्षेत्रों में परियोजनाएं हैं। हिप्पोकैम्पस के संबंध में एंटोराहिनल कॉर्टेक्स की शारीरिक स्थिति के कारण, स्लाइस तैयारी31के भीतर पूरी तरह से बरकरार छिद्रपूर्ण पथ फाइबर को बनाए रखने के लिए क्षैतिज मस्तिष्क स्लाइस एक आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, क्षैतिज टुकड़ा करने की क्रिया आदर्श रूप से काई फाइबर को संरक्षित करतीहै जो हिप्पोकैम्पस9,30,50के भीतर डेंटेट जाइरस से सीए 3 न्यूरॉन्स तक परियोजना करती है। इसलिए, यह तैयारी विधि अध्ययनों के लिए उच्च मूल्य की है जो हिप्पोकैम्पस इनपुट रास्तों और डीजी से संबंधित प्रक्रियाओं की जांच करती है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल श्फर कोलैटरल पाथवे50की जांच की अनुमति देता है। हालांकि, SAGittal और कोरोनल मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी अधिक आमतौर पर जब CA3 CA1 फाइबर अनुमानों की जांच कर रहे हैं, संभवतः क्योंकि उनके थोड़ा तेजी से तैयारी समय है कि उच्च गुणवत्ता स्लाइस प्राप्त करने की संभावना बढ़ सकती है । फिर भी, क्षैतिज हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयारी एक शक्तिशाली अनुसंधान उपकरण प्रस्तुत करती है क्योंकि यह एक स्लाइस गोलार्द्ध के भीतर सभी हिप्पोकैम्पस फाइबर रास्तों के संरक्षण और जांच की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब सर्किट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया जाता है, उदाहरण के लिए, मल्टी इलेक्ट्रोड परख रिकॉर्डिंग में।
मस्तिष्क स्लाइस तैयार करते समय एक बड़ी चिंता मस्तिष्क के ऊतकों का उचित संरक्षण है। यह हमारे प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों द्वारा पूरा किया जाता है, जिसमें एक तेजी से विच्छेदन, ऊतक की निरंतर और पर्याप्त ऑक्सीजन और ठंडा होना, और कम सोडियम, उच्च सुक्रोज टुकड़ा करने की क्रिया समाधान39,51के साथ सुरक्षात्मक काटने की विधि के उपयोग से मस्तिष्क के ऊतकों की सुरक्षा शामिल है। इस तथ्य के बावजूद कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल 90% के आसपास सफलता दर प्रदान करता है, पुराने या आनुवंशिक रूप से विविध जानवरों से प्राप्त ऊतकों के साथ काम करते समय या एक विशिष्ट कोशिका आबादी को संरक्षित करने की कोशिश करते समय संभावित अतिरिक्त सुरक्षात्मक कदम उठाने की आवश्यकता हो सकती है। संवेदनशील मस्तिष्क ऊतक की तैयारी की रक्षा के लिए पहले से ही कई तरीकों की सूचना दी गई थी। इन तरीकों में सोडियम परमीशन52को कम करने के लिए एनएमडीजी आधारित स्लाइसिंग समाधानों का उपयोग, एनएमडीए रिसेप्टर गतिविधि को अवरुद्ध करने के लिए स्लाइसिंग समाधान में उच्च मैग्नीशियम के स्तर का उपयोग और वसूली अवधि23के दौरान सुरक्षात्मक समाधानों का लंबे समय तक उपयोग करना शामिल है। इन सभी उपायों के परिणामस्वरूप कम एक्सटॉक्सिकिटी होगी। इसके अतिरिक्त, पुराने जानवरों के साथ काम करते समय बर्फ-ठंडे सुरक्षात्मक ACSF समाधानों के साथ एक ट्रांस-कार्डियल परफ्यूजन अक्सर नियोजित और आवश्यकहोताहै।
तीव्र हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस आदर्श रूप से अनुकूल हैं और बड़े पैमाने पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए उपयोग किए जाते हैं जैसे कि उच्च आयाम संकेत जो अपेक्षाकृत मोटी (300-500 माइक्रोन) तीव्र मस्तिष्क स्लाइस से प्राप्त किए जा सकते हैं, जो शोर अनुपात11के लिए एक उच्च संकेत की गारंटी देता है। मानक रूप से उपयोग किए जाने वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अनुप्रयोगों में वोल्टेज या वर्तमान-क्लैंप मोड में एक्स्ट्रासेलुलर फील्ड रिकॉर्डिंग और इंट्रासेलुलर पूरी सेल रिकॉर्डिंग शामिल हैं। उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा प्राप्त करने के लिए, स्लाइस स्वास्थ्य प्राथमिक चिंता का विषय है और प्रस्तुत प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन करके गारंटी दी जा सकती है। हालांकि, स्लाइस तैयारी एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक पेश करती है, इसलिए प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत से पहले एक गुणवत्ता की जांच नियमित रूप से शामिल की जानी चाहिए। कई मापदंडों का उपयोग स्लाइस की गुणवत्ता जांच के रूप में किया जा सकता है और इनपुट-आउटपुट घटता और बेसलाइन एफईपीएसपी या ईपीएससी रिकॉर्डिंग19के माध्यम से मानक रूप से मूल्यांकन किया जाता है। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उप-विशिष्ट विद्युत भौतिक गुण इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग, ओरिएंटेशन या यहां तक कि नुकसान जैसी प्रायोगिक त्रुटियों से उत्पन्न हो सकते हैं और पूरी तरह से तैयार स्लाइस के स्वास्थ्य का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसलिए, 40x उद्देश्य या डीएपीआई नाभिक धुंधला के तहत कोशिकाओं के सरल दृश्य और मूल्यांकन जैसे अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण करने की सलाह दी जाती है। इस तरह की गुणवत्ता की जांच कई टुकड़ा तैयारी सत्रों पर लगातार टुकड़ा स्वास्थ्य की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कैल्शियम माइक्रोफ्लोरिमेट्री हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस का अध्ययन करने के लिए कम आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीक प्रस्तुत करता है। हालांकि, यह तकनीक मानक बाह्य और इंट्रासेलुलर इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए अतिरिक्त मूल्य की है, क्योंकि यह इंट्रासेलुलर कैल्शियम फ्लक्स की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, जो न्यूरोनल और सिनेप्टिक सिग्नलिंग में उच्च महत्व के हैं। इंट्रासेलुलर कैल्शियम सांद्रता में परिवर्तन न्यूरोट्रांसमीटर वेसिकल रिलीज, पोस्टसिनैप्टिक संभावित पीढ़ी, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का विनियमन और अक्षीय तंत्रिका चालन54,55,56में शामिल हैं। इस तकनीक(चित्रा 4)के एक उदाहरण के रूप में, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कैल्शियम डाई का उपयोग किया। यकीनन, कैल्शियम रंगों के साथ ऊतक स्लाइस के उपचार से बढ़ी हुई प्रयोगात्मक समय सीमा के साथ-साथ निचले स्थित न्यूरोनल कोशिकाओं की अक्षम लोडिंग जैसी कठिनाइयां उत्पींन हो सकती हैं। हालांकि, इस तकनीक पर बदलाव इन तकनीकी चुनौतियों को दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस स्लाइस में कैल्शियम माप और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को जोड़ना संभव है। इस तरह, एक कैल्शियम फ्लोरोसेंट डाई पैच पिपेट के माध्यम से एक विशिष्ट कोशिका में लोड किया जा सकता है, ब्याज57की एक विशिष्ट कोशिका में कैल्शियम गतिशीलता के माप की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, कैल्शियम संकेतक, GCaMP58,या तो पूरे मस्तिष्क में, या एक सेल विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित व्यक्त आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों का उपयोग किया जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि जीएमपी जानवरों से मस्तिष्क ऊतक ब्याज के प्रोटीन के लिए एक सीधा लिंकर के साथ न्यूरोनल अभिव्यक्ति पैटर्न निर्धारित करने या कैल्शियम स्पार्क्स और तरंगों में शामिल होने की जांच करने के अवसर प्रदान कर सकता है।
कुल मिलाकर, हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और इमेजिंग रिकॉर्डिंग के लिए चूहों से स्वस्थ और व्यवहार्य क्षैतिज हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस की सफल तैयारी के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं। यह पद्धति मस्तिष्क की विकृतियों में होने वाले न्यूरोलॉजिकल परिवर्तनों तक पहुंचने के लिए बहुत उपयोगी है जो डेंटेट जाइरस में वर्णित हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम अपनी शोध सुविधाओं के उपयोग के लिए डॉ कीम्पे वीरडा और प्रो डॉ जोरिस डी बुद्धि की देखरेख में मस्तिष्क और रोग अनुसंधान के लिए VIB-KU Leuven केंद्र की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी इकाई को धन्यवाद देते हैं । इसके अलावा, हम आयन चैनल अनुसंधान की प्रयोगशाला के सभी सदस्यों और एंडोमेट्रियम, एंडोमेट्रियोसिस और प्रजनन चिकित्सा की प्रयोगशाला केयू Leuven में उनके सहायक चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देते हैं।
इस परियोजना को रिसर्च फाउंडेशन-फ्लैंडर्स (G.084515N और G.0B1819N से जेवी) और केयू Leuven के अनुसंधान परिषद (C1-funding C14/18/106 से जेवी) को धन प्राप्त हुआ है । केपी एक एफडब्ल्यूओ [पेगासस]2 मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी फेलो है और मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट (665501) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से फंडिंग प्राप्त की, जिसमें रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) (12T0317N) है। केएच रिसर्च फाउंडेशन फ्लैंडर्स, बेल्जियम (12U7918N) का पोस्टडॉक्टोरल फेलो है।
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
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Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |