Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.
O hipocampo é uma estrutura altamente organizada no cérebro que faz parte do sistema límbico e está envolvida na formação e consolidação da memória, bem como na manifestação de doenças cerebrais graves, incluindo doença de Alzheimer e epilepsia. O hipocampo recebe um alto grau de intra e interconectividade, garantindo uma comunicação adequada com estruturas cerebrais internas e externas. Essa conectividade é realizada através de diferentes fluxos informacionais na forma de vias de fibra. As fatias cerebrais são uma metodologia frequentemente utilizada ao explorar funções neurofisiológicas do hipocampo. As fatias cerebrais hipocampais podem ser usadas para várias aplicações diferentes, incluindo gravações eletrofisiológicas, medidas microscópicas leves, bem como várias técnicas biológicas moleculares e histoquímicas. Portanto, as fatias cerebrais representam um sistema modelo ideal para avaliar funções proteicas, para investigar processos fisiofisiológicos envolvidos em distúrbios neurológicos, bem como para fins de descoberta de drogas.
Existem várias formas diferentes de preparos de fatias. As preparações de fatias cerebrais com um vibratome permitem uma melhor preservação da estrutura tecidual e garantem um suprimento suficiente de oxigênio durante o corte, que apresentam vantagens sobre o uso tradicional de um helicóptero de tecido. Além disso, diferentes planos de corte podem ser aplicados para preparações de fatias cerebrais vibratome. Aqui, um protocolo detalhado para uma preparação bem sucedida de fatias hipocampais horizontais de cérebros de camundongos com corte de vibratome é fornecido. Em contraste com outras preparações de fatias, o corte horizontal permite manter as fibras do caminho de entrada hipocampal (caminho perfurante) em um estado totalmente intacto dentro de uma fatia, o que facilita a investigação de interações entorhinal-hipocampal. Aqui, fornecemos um protocolo minucioso para a dissecção, extração e corte horizontal agudo do cérebro murino, e discutimos desafios e potenciais armadilhas desta técnica. Finalmente, mostraremos alguns exemplos para o uso de fatias cerebrais em outras aplicações.
A extensa exploração do hipocampo começou quando Scoville e Milner relataram a incapacidade de um paciente (H.M.) de formar uma nova memória declarativa após a remoção cirúrgica do hipocampo e das estruturas do lobo temporal próximo como tratamento para epilepsia grave1. A partir desse momento, o hipocampo tem sido estudado extensivamente desde propriedades neuronais gerais e funções até o desenvolvimento de doenças cerebrais graves, como epilepsia e doença de Alzheimer2,3,4,5. O hipocampo faz parte do sistema límbico, consistindo de um grupo de estruturas cerebrais relacionadas envolvidas na formação de emoção e memória6,7. Uma densa rede de várias vias de fibra realiza uma conectividade hipocampal apertada com estruturas cerebrais internas e externas. Essas vias incluem o caminho perforante medial e lateral (córtex entorhinal para dento gyrus, CA3 – CA1 e subiculum)8, o caminho de fibra de musgo (giro dento para CA3)9 e a via bilateral/associacional Schaffer (CA3 a CA1)10 (Figura 1). O hipocampo apresenta uma das áreas cerebrais mais amplamente exploradas até agora devido à sua organização laminar altamente conservada da formação de camadas neuronais, e a possibilidade de obter culturas neuronais vitais e fatias cerebrais com relativa facilidade5.
Figura 1: Desenho animado ilustrando as diferentes regiões hipocampais e principais caminhos de fibra. As diferentes regiões hipocampais são indicadas por linhas coloridas sólidas: córtex entorhinal (CE; preto), giro dento (DG; laranja), Cornu Ammonis (CA) 3 (ciano), 2 (amarelo) e 1 (magenta), e o subiculum (verde). As vias de fibra são mostradas com uma linha pontilhada colorida: o caminho medial (MPP, vermelho) e perforante lateral (LPP, azul) (do córtex entorhinal ao giro dentado, CA3, CA1 e subiculum), a via de fibra de musgo (MF, violeta) (do giro dentado ao CA3) e a garantia Schaffer (SC, marrom) (ipsilateral de CA3 a CA1)/vias comissurais associacionais (AC, verde claro) (contralateral de CA3 a CA1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocolos de fatia cerebral muitas vezes resultam na perda de conexões de áreas cerebrais mais distantes para a área de interesse5. Além disso, os capilares não são mais funcionais5 e a circulação sanguínea é privada11. Apesar dessas limitações, as fatias cerebrais ainda são usadas principalmente para a investigação de funções neurofisiológicas do hipocampo devido a uma série de vantagens. Primeiro, a extração do hipocampo é rápida12 e não requer muitos materiais. Os únicos instrumentos essenciais incluem um kit de dissecção, um banho de água de laboratório, acesso ao carbogen e um microtome vibratório (vibratome)13. Outros ativos da técnica de fatia cerebral são a evasão da barreira hemencefálica -cérebro (BBB) e a lavagem de moléculas liberadas endógenamente antes do início do experimento5, o que torna possível estudar o efeito de drogas com controle de dosagem relativamente preciso14. Além disso, as fatias cerebrais preservam a cito-arquitetura e os circuitos sinápticos dentro do hipocampo15,16, onde a neuronatomia e o ambiente local com conectividade neuronal e interações complexas neurônio-glia são preservados4,11,17. Além disso, as conexões de fibra hipocampal são predominantemente unidirecionais e os neurônios hipocampais têm uma alta plasticidade sináptica, o que simplifica tremendamente a coleta e interpretação de gravações eletrofisiológicas de alta qualidade para entender os processos neurológicos18,19. É importante ressaltar que as fatias cerebrais apresentam um valioso ativo aplicável em uma ampla gama de diferentes técnicas científicas, abrangendo desde técnicas biológicas moleculares sobre registros de imagens até medições eletrofisiológicas12,20,21,22,23,24,25,26.
Como descrito acima, as fatias cerebrais hipocampais apresentam uma poderosa ferramenta experimental para estudar características estruturais e funcionais da conectividade sináptica. Isso oferece a oportunidade de avaliar os efeitos de produtos químicos ou mutações na excitabilidade neuronal e plasticidade16.
Preparações agudas de fatias cerebrais estão apresentando uma técnica relativamente sensível e a qualidade ideal da fatia é altamente dependente de condições experimentais ideais, incluindo a idade do animal, o método de eutanásia, a velocidade de dissecção e fatiamento, as soluções e parâmetros de corte (por exemplo, velocidade de corte) bem como as condições para recuperação de fatias4. Portanto, um protocolo bem desenhado é de maior importância e garante a reprodutibilidade em diferentes unidades de pesquisa13.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para preparações agudas de fatias hipocampais horizontais horizontais, com o objetivo de preservar a integridade do caminho de perfuração lateral e medial hipocampal e da via de fibra de musgo, permitindo a investigação dos processos relacionados ao giro dento9. Descreveremos em detalhes os principais passos para dissecar, extrair e fatiar horizontalmente o cérebro murino, seguido por resultados representativos de gravações microfluorimétricas de cálcio e gravações potenciais postinos (fEPSPs) em condições básicas e durante protocolos de indução de LTP em fatias cerebrais de camundongos tipo selvagem C57BL/6J.
Embora comumente usado entre a comunidade neurociência, as preparações de fatias cerebrais também são confrontadas com várias desvantagens. Por exemplo, as conexões de entrada e saída para as áreas de interesse do cérebro não estão mais conectadas em uma fatia cerebral. Além disso, uma vez isolado, o tecido começa a se degradar lentamente ao longo do tempo e esse processo pode alterar as condições fisiológicas da fatia cerebral. Este tópico, em particular, é muito preocupante porque a maioria das gravações de fatias cerebrais estão levando vários minutos a horas, o que resulta em longos dias experimentais com gravações realizadas em tecido que foi isolado até 6-8 h antes do início do experimento. Além disso, o fluido cefalorraquidiano e a circulação sanguínea são interrompidos durante as preparações de fatias, o que pode levar à falta de compostos endógenos importantes dentro de uma fatia cerebral. E, obviamente, o procedimento de corte em si pode causar danos nos tecidos mecânicos que podem comprometer os resultados obtidos. No entanto, os benefícios reais das preparações de fatias cerebrais ainda estão superando suas desvantagens, e é por isso que eles apresentam uma técnica altamente valorizada e empregada em pesquisas de neurociência.
As fatias cerebrais hipocampais agudas apresentam uma técnica poderosa e, portanto, amplamente utilizada para investigar processos neuronais de um nível molecular até estudos complexos de circuito cerebral. Isso é baseado na neuronatomia ideal do hipocampo que pode ser facilmente preservada em uma preparação de fatia18. Consequentemente, as fatias cerebrais hipocampais são usadas em uma ampla variedade de projetos de pesquisa científica, incluindo triagens de medicamentos17, estudos de propriedades neuronais e sinápticas envolvidas nas funções cognitivas40,41, e investigações das condições cerebrais patológicas14,42,43. No entanto, um amplo espectro de diferentes aplicações também causa uma ampla gama de protocolos de preparação de fatias disponíveis que podem diferir em vários parâmetros, como condições de dissecção e orientação de plano de corte, entre outros. Portanto, a questão exata da pesquisa de um projeto científico deve ser determinada para escolher um protocolo adequado de preparação de fatias.
O helicóptero de tecido apresenta uma das técnicas mais antigas usadas para preparar as fatias cerebrais hipocampais44,45. As principais vantagens deste método de preparação incluem o baixo custo do helicóptero e o uso rápido e fácil46. No entanto, os helicópteros de tecido causam estresse mecânico que resulta em alterações morfológicas e morte celular47. Em comparação, o vibratome é uma máquina bastante cara e o tempo de preparação da fatia é significativamente aumentado, o que pode ter um impacto na qualidade da fatia. No entanto, o vibratome geralmente oferece uma maneira mais suave de separar as fatias do tecido e permite manter o cérebro bem resfriado e oxigenado durante todo o procedimento de isolamento, melhorando assim as propriedades da fatia46. Portanto, vários grupos estão utilizando normalmente essa técnica e apresentaram protocolos para a preparação de fatias cerebrais hipocampais agudas usando o vibratome16,30,48. Enquanto alguns protocolos fornecem apenas alguns detalhes para o fatiamento em si, mas sim se concentram em uma aplicação específica de tal preparação defatias 48, outros fornecem protocolos de fatias detalhados que diferem em cortar planos ou outros detalhes de protocolo (por exemplo, agarose incorporando ou fatiando/recuperação de soluções) dadas neste artigo27,30.
O protocolo descrito aqui apresenta um método simples a fim de preparar fatias cerebrais de camundongos hipocampais horizontais de alta qualidade de animais jovens. O protocolo é particularmente útil para preservar o caminho perfurante (medial e lateral) que apresenta a via de entrada hipocampal, que projeta desde o córtex entorhinal até o hipocampo8,49,50. As preparações isoladas de fatias transversais do hipocampo não preservam adequadamente o caminho perfurante, que se origina principalmente das camadas II e V do córtex entorhinal e projeta várias áreas dentro do hipocampo18. Devido ao posicionamento anatômico do córtex entorhinal em relação ao hipocampo, as fatias horizontais do cérebro são uma necessidade para manter fibras de caminho perfurantes totalmente intactas dentro da preparação da fatia31. Além disso, o corte horizontal preserva idealmente as fibras musgosas que projetam desde o giro dento até os neurônios CA3 dentro do hipocampo9,30,50. Portanto, este método de preparação é de alto valor para estudos que investiguem vias de entrada hipocampal e processos relacionados ao DG. Além disso, este protocolo permite a investigação da via colateral schaffer50. No entanto, as preparações de fatias cerebrais sagitas e coronais são mais comumente usadas ao investigar projeções de fibras CA3 para CA1, presumivelmente devido ao seu tempo de preparação ligeiramente mais rápido que pode aumentar a chance de obter fatias de alta qualidade. No entanto, as preparações horizontais de fatias hipocampais apresentam uma poderosa ferramenta de pesquisa, uma vez que permite a preservação e investigação de todas as vias de fibra hipocampal dentro de um hemisfério fatiado. Isso pode ser particularmente útil quando as respostas do circuito são estudadas, por exemplo, em gravações de ensaio de vários eletrodos.
Uma grande preocupação ao preparar fatias cerebrais é a preservação adequada do tecido cerebral. Isso é realizado por várias etapas críticas em nosso protocolo, incluindo uma dissecção rápida, a oxigenação contínua e suficiente e o resfriamento do tecido, e a proteção do tecido cerebral pelo uso do método de corte protetor com uma solução de corte de baixa sódio e alta sacarose39,51. Apesar do fato de que o protocolo descrito aqui produz uma taxa de sucesso em torno de 90%, medidas de proteção potencialmente adicionais podem ser necessárias ao trabalhar com tecidos derivados de animais mais velhos ou geneticamente diversos ou quando se tenta preservar uma população celular específica. Vários métodos já foram relatados para proteger preparações sensíveis de tecidos cerebrais. Esses métodos incluem o uso de soluções de corte baseadas em NMDG para reduzir a permeação de sódio52,o uso de altos níveis de magnésio na solução de corte, a fim de bloquear a atividade do receptor NMDA53,e o uso prolongado de soluções protetoras também durante o períodode recuperação 23. Todas essas medidas resultarão em uma redução da excitoxicidade. Além disso, uma perfusão trans-cardíaca com soluções ACSF protetoras geladas é frequentemente empregada e necessária ao trabalhar com animais mais velhos27.
As fatias cerebrais hipocampais agudas são idealmente adequadas e amplamente utilizadas para estudos eletrofisiológicos por razões como os sinais de alta amplitude que podem ser obtidos a partir de uma fatia cerebral aguda relativamente grossa (300-500 μm), o que garante um alto sinal à razão de ruído11. Aplicações eletrofisiológicas usadas de forma padronizada incluem gravações de campo extracelulares e gravações de células inteiras intracelulares em um modo de tensão ou fixação corrente. Para adquirir dados eletrofisiológicos de alta qualidade, a saúde da fatia é de preocupação primária e pode ser garantida seguindo rigorosamente o protocolo apresentado. No entanto, como os preparos de fatias apresentam uma técnica altamente sensível, uma verificação de qualidade deve ser rotineiramente incluída antes do início de cada experimento. Vários parâmetros podem ser usados como verificação de qualidade da fatia e são avaliados de forma padronizada através de curvas de saída de entrada e gravações de fEPSP ou EPSC de linha de base19. No entanto, deve-se notar que as propriedades eletrofisiológicas subótimas podem surgir de erros experimentais como posicionamento de eletrodos, orientação ou mesmo danos e não representam apenas a saúde da fatia preparada. Portanto, é aconselhável realizar controles adicionais de qualidade, como visualização simples e avaliação das células sob um objetivo de 40x ou uma coloração do núcleo DAPI. Essas verificações de qualidade podem ser usadas para confirmar a saúde constante da fatia em várias sessões de preparação de fatias.
A microfluorimetria de cálcio apresenta uma técnica menos usada para estudar as fatias cerebrais hipocampais. No entanto, essa técnica é de valor adicional às gravações padrão de eletrodos extracelulares e intracelulares, pois permite visualizar e quantificar fluxos de cálcio intracelulares, que são de alta importância na sinalização neuronal e sináptica. Alterações nas concentrações intracelulares de cálcio estão envolvidas na liberação de vesículas neurotransmissores, geração potencial postsintáptica, regulação da plasticidade sináptica e condução do nervo axonal54,55,56. Como ilustração desta técnica (Figura 4), fizemos uso de um corante de cálcio comercialmente disponível. Indiscutivelmente, o tratamento de fatias de tecido com corantes de cálcio pode produzir dificuldades como um aumento do tempo experimental, bem como o carregamento ineficiente de células neuronais mais baixas. No entanto, variações nesta técnica poderiam ser usadas para contornar esses desafios técnicos. Por exemplo, é possível combinar medidas de cálcio e gravações de grampos em fatias hipocampais. Dessa forma, um corante fluorescente de cálcio poderia ser carregado em uma célula específica através da pipeta de remendo, permitindo as medidas da dinâmica do cálcio em uma célula específica de interesse57. Alternativamente, animais geneticamente modificados expressando o indicador de cálcio, GCaMP58, seja em todo o cérebro, ou conduzidos por um promotor específico de células, poderiam ser usados. Curiosamente, o tecido cerebral de animais GCaMP com um linker direto a uma proteína de interesse poderia fornecer oportunidades para determinar o padrão de expressão neuronal ou investigar o envolvimento em faíscas e ondas de cálcio.
Ao todo, fornecemos as diretrizes para a preparação bem sucedida de fatias cerebrais hipocampais horizontais saudáveis e viáveis de camundongos para gravações eletrofisiológicas e de imagem. Essa metodologia é muito útil para acessar alterações neurológicas que ocorrem em patologias cerebrais descritas no giro dentado.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à unidade de Eletrofisiologia do VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research sob a supervisão do Dr. Keimpe Wierda e do Prof. Dr. Joris De Wit pelo uso de suas instalações de pesquisa. Além disso, agradecemos a todos os membros do Laboratório de Pesquisa do Canal de Íons e do Laboratório de Endométrio, Endometriose e Medicina Reprodutiva do KU Leuven por suas discussões e comentários úteis.
Este projeto recebeu financiamento da Research Foundation-Flanders (G.084515N e G.0B1819N para J.V.) e do Conselho de Pesquisa do KU Leuven (C1-funding C14/18/106 a J.V.). K.P. é uma FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie Fellow e recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie (665501) com a Research Foundation Flanders (FWO) (12T0317N). K.H. é pós-doutorando da Fundação de Pesquisa Flandres, Bélgica (12U7918N).
Anesthesia chamber | home made – Generic | N/A | plexiglas |
Anesthesia vaporizer | Dräger & MSS International Ltd | Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane | to vaporize isoflurane for rodent anesthetization |
Barrels for the perfusion system | TERUMO | Hypodermic syringes without needle | https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html |
Bicuculline methiodide | hellobio | HB0893 | https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html |
Borosilcate glass capillaries | Science Products | GB150F-8P | https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished |
Calcium chlorid dihydrate | Merck | 102382 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Calcium Imaging software | Till Photonics | LiveAcquisition v2.3.0.18 | |
Carbogen tank | Air Liquide | Alphagaz mix B50 | Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5 |
Cluster microelectrode | FHC | CE2C55 | https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/ |
Culture dish (35 mm) | Corning Life Sciences | 353001 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001 |
Culture dish (90 mm) | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20 |
Curved forceps | Fine Science tools | 11270-20 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20 |
D-AP5 | hellobio | HB0225 | https://www.hellobio.com/dap5.html |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma Aldrich | 16301 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE |
Digital CMOS camera | HAMAMATSU | ORCA-spark C11440-36U | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html |
Dissection scissors | Fine Science tools | 14058-09 | https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09 |
DNQX | hellobio | HB0262 | https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html |
EMCCD camera | Andor | iXon TM + DU-897E-CSO-#BV | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE |
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier | HEKA Elektronik | 895278 | https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf |
Filter paper | VWR | 516-0818 | grade 413 |
Fine brush | Raphael Kaerell | 8204 | Size #1 |
18G needle | Henke Sass Wolf Fine-Ject | 18G X 1 1/2" 4710012040 | https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/ |
Isoflurane | Dechra Veterinary Products | Iso-Vet 1000mg/g | 250 ml bottle |
Loctite 406 | Henkel Adhesive technologies | Loctite 406 | Super glue |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 105886 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-10 with SM-7 remote control system | https://www.luigs-neumann.org |
Microscope (for calcium imaging) | Olympus | BX51WI | https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/ |
Microscope (for ephys recordings) | Zeiss | Axio Examiner.A1 | https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/ |
Microscope light source | CAIRN Research | dual OptoLed power supply | https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/ |
Monochromator | Till Photonics | Polychrome V | |
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA) | Sigma Aldrich | M3262 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE |
Oregon Green® 488 BAPTA-1 | Invitrogen Molecular Probes | #06807 | 10x50ug |
Osmometer | Wescor | 5500 vapor pressure osmometer | to verify osmolarity of salt solutions |
Peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | Masterflex C/L 77120-62 | https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229 |
pH meter | WTW | inoLab series pH 720 | https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html |
Potassium chlorid | Chem-lab | CL00.1133 | https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528 |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Razor blade to prepare hemispheres | SPI supplies | Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10 | GEM Scientific Single Edge Razor Blades |
Razor blade for vibratome | Ted Pella Inc | 121-6 | double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel) |
Recovery chamber | home made – Generic | N/A | to collect and store brain slices in (see details in manuscript) |
Scissors | Any company | N/A | Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation |
Silver electrode wire | Any company | for recording and reference electrodes | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merck | 106342 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Sodium hydrogen carbonate | Alfa Aesar | 14707 | https://www.alfa.com/en/catalog/014707/ |
Sodium chlorid | Fisher Scientific | S/3160/60 | https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420 |
Software for field recordings | HEKA Elektronik | PatchMaster | https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf |
Spatula | Sigma Aldrich | S9147-12EA | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE |
Stimulator | A.M.P.I | ISO-FLEX | http://www.ampi.co.il/isoflex.html |
Sucrose | VWR International Ltd. | 102745C | https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1 | Warner Instruments | 64-0167 | Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems |
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2 | Fisher Scientific | 800/100/200 & 800/100/280 | Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing |
Vacuum pump | home made – Generic | N/A | |
8 valve multi-barrel perfusion system | home made | N/A | consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table) |
Magnetic valves (to control the perfusion lines) | NResearch Inc. | p/n 161P011 | https://nresearch.com/ |
Vibratome | Leica | 14912000001 | Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200 |
Water bath | Memmert | WNB 7 | https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf |
Water purification system | Merck | Synergy millipore | to obtain highly purified water |
12-well plates | Greiner Bio-One | CELLSTAR, 665180 | http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf |