Elektrofysiologiske målinger fra levende hippocampale skiver in vitro er en kraftfuld eksperimentel tilgang med mange fordele. Eksperimentatoren kan bruge et mikroskop, mikromanipulatorer og et optagelsessystem til direkte at visualisere og indsamle målinger fra individuelle neuroner i vævet. Vævsskiver er også meget tilgængelige for fototimulation eller lægemiddellevering til optogenetiske, kemogenetiske eller farmakologiske eksperimenter.

Hippocampal-netværket genererer meget synkron befolkningsaktivitet in vivo, synlig som svingninger i det ekstracellulære lokale feltpotentiale^1,2,3,4,5. Brain slice metoder er blevet udnyttet til at få indsigt i de cellulære og kredsløb mekanismer, der ligger til grund for disse neuronale netværk svingninger. Foundational arbejde fra Maier et al. viste, at skarpe bølge-krusning komplekser (SWRs) kan opstå spontant i skiver af ventral hippocampus^6,7. Efterfølgende undersøgelser fra flere efterforskere har gradvist belyst mange aspekter af stålwirer, herunder neuromodulatorernes rolle i reguleringen af hippocampus 8 ,^9,10 og de synaptiske mekanismer, der driver in vitro-reaktivering af neuronale ensembler, der tidligere var aktive under adfærd in vivo¹¹. Brain slice eksperimenter har også givet indsigt i gamma rækkevidde svingning (30-100 Hz), en særskilt hippocampal netværk tilstand menes at støtte hukommelse kodning og huske^12,13. Endelig anerkender den centrale rolle hippocampus og tilknyttede strukturer i patofysiologien af temporal lobe epilepsi^14,15, forskere har brugt hippocampale skivepræparater til at undersøge generering og formering af epileptiform aktivitet. Carter et al. påviste, at kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver fremstillet af kronisk epileptiske dyr spontant kan generere epileptiform udledninger in vitro¹⁶. Efterfølgende undersøgte Karlócai et al. de mekanismer, der ligger til grund for epileptiformudladninger i hippocampale skiver ved hjælp af modificeret kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med ændrede ionkoncentrationer (reduceret Mg²⁺ eller forhøjet K⁺) eller tilsat stoffer (4AP eller gabazin)¹⁷.

Efterforskere har udviklet adskillige hippocampale skive tilgange, der adskiller sig på centrale måder: (1) regionen hippocampus indeholdt i skiven (dorsal, mellemliggende eller ventral); 2) tilstedeværelsen eller fraværet af ekstrahippocampal væv såsom entorhinal cortex; (3) den orientering, der anvendes til at skære skiver (koronar, sagittal, vandret eller skrå) og (4) de forhold, hvorunder vævet holdes efter udskæring (nedsænket fuldt ud i ACSF eller holdes ved grænsefladen mellem ACSF og befugtet, carbogen-rig luft).

Valget af, hvilken udskæringsmetode der skal anvendes, bør bestemmes af forsøgsmålsætningen. For eksempel, tværgående eller koronar skiver af dorsale hippocampus opretholdes under neddykkede forhold er blevet brugt meget effektivt til undersøgelse af intrahippocampal kredsløb og synaptisk plasticitet^18,19,20. Sådanne præparater genererer dog ikke spontant netværkssvingninger så let som skiver fra ventral hippocampus^21,22,23. Selv om en tilstand af vedvarende SWR-aktivitet kan fremkaldes ved stivkrampe stimulation i tværgående skiver fra den dorsale og ventrale hippocampus²⁴, observeres spontane stålwirer lettere i ventralskiver^7,25.

En iboende fysiologisk og anatomisk skelnen mellem den dorsale og ventral hippocampus understøttes af undersøgelser udført både in vivo og in vitro²⁶. Optagelser i rotter afslørede stærkt sammenhængende theta rytmer i hele dorsale og mellemliggende hippocampus, men dårlig sammenhæng mellem ventral regionen og resten af hippocampus²⁷. Stålwirer in vivo formerer sig let mellem den dorsale og mellemliggende hippocampus, mens stålwirer, der stammer fra den ventrale hippocampus, ofte forbliver lokale²⁸. De foreningsmæssige fremskrivninger stammer fra CA3 pyramide neuroner, der bor i den dorsale og mellemliggende hippocampus projekt lange afstande langs langs langsgående akse hippocampus. CA3-fremskrivninger fra ventrale regioner er fortsat relativt lokale og er derfor mindre tilbøjelige til at blive afbrudt under udskæringsprocessen^29,30. Ventralskiver kan derfor bedre bevare det tilbagevendende netværk, der er nødvendigt for at generere befolkningssynkronisering. Tilbøjeligheden af ventrale skiver til at generere spontane netværksaktiviteter in vitro kan også afspejle højere iboende excitabilitet af pyramide neuroner eller svagere GABAergic hæmning i ventral hippocampus i forhold til mere dorsale regioner³¹. Faktisk ventral hippocampal skiver er mere modtagelige for epileptiform aktivitet^32,33. Således har mange undersøgelser af spontane fysiologiske^8,9,11,24 eller patologiske^16,34,35,36 netværkssvingninger traditionelt brugt en vandret udskæringsmetode, nogle gange med en lille vinkel i fronto-occipital retning, som giver vævsskiver parallelt med det tværgående plan af ventral hippocampus.

Netværksforbindelsen påvirkes uundgåeligt af udskæringsproceduren, da mange celler i skiven vil blive afbrudt. Vinklen og tykkelsen af skiven og vævet, der tilbageholdes i præparatet, bør overvejes for at optimere forbindelsen i de kredsløb, der er af interesse. Mange undersøgelser har udnyttet horisontale kombinerede hippocampal-entorhinal cortex skiver (HEC) til at udforske interaktioner mellem de to strukturer i forbindelse med fysiologiske eller patologiske netværk svingninger. Roth et al. udførte dobbelte optagelser fra CA1-underfeltet i hippocampus og lag V i den mediale entorhinale cortex for at demonstrere udbredelse af SWR-aktivitet gennem HEC-skiven³⁷. Mange undersøgelser af epileptiform aktivitet har brugt HEC skive forberedelse til at undersøge, hvordan epileptiform udledninger formere sig gennem corticohippocampal netværk^16,35,36,38. Det er vigtigt at bemærke, at bevarelse af den intakte kortikohippocampal sløjfe ikke er en forudsætning for spontane stålwirer, epileptiformudladninger eller gammasvingninger; netværk svingninger kan genereres i tværgående skiver af dorsale eller ventral hippocampus uden vedlagte parahippocampal væv^{21,22,23, 25,39,40,41}. En vigtigere faktor for den spontane generering af netværkssvingninger i hippocampale skiver kan være tykkelsen af hver skive, da en tykkere skive (400-550 μm) vil bevare mere forbindelse i CA2/CA3 tilbagevendende netværk^21,22,25.

Selv om vinklede vandrette HEC-skiver (skåret med en ca. 12° vinkel i fronto-occipital retning) er blevet brugt til at studere den funktionelle forbindelse mellem kortikohippocampal loop^{11,16,34,35,42}, er sådanne vinklede præparater ikke nødvendige for spontan netværksaktivitet^43,44,45. Brugen af et vinklet udskæringsplan gør det dog muligt for investigator selektivt at lave skiver, der bedst bevarer den tværgående orienterede lameller af enten ventral eller mellemliggende hippocampus, afhængigt af om der anvendes en nedadgående eller en opadgående vinkel (Figur 1). Denne tilgang er begrebsmæssigt svarer til den, der anvendes af Papatheodoropoulos et al., 2002, der dissekeret hver hippocampus fri og derefter brugt en væv chopper til at skabe tværgående skiver langs hele dorsal-ventral akse²¹. I lyset af ovennævnte funktionelle sondringer mellem den ventrale og dorsale mellemliggende hippocampus bør efterforskerne overveje skivernes anatomiske oprindelse, når de udformer eksperimenter eller fortolker resultater. Brug af en agar rampe under udskæringsproceduren er en enkel måde at fortrinsvis producere skiver fra enten den mellemliggende eller ventral hippocampus.

Hippocampal skiver kan opretholdes i enten en nedsænket kammer (med vævet fuldt nedsænket i ACSF), eller en grænseflade-stil kammer (f.eks Oslo eller Haas kammer, med skiver, der kun er omfattet af en tynd film af flydende medier). Interface vedligeholdelse øger iltning af vævet, som fremmer neuronal overlevelse og giver mulighed for vedvarende høje niveauer af internuronal aktivitet. Traditionelt bruger neddykkede optagelsesforhold en langsommere ACSF-strømningshastighed, der ikke giver tilstrækkelig iltning af væv til stabilt udtryk for svingninger på netværksniveau. I neddykkede hippocampale skiver observeres carbachol-inducerede gammasvingninger kun forbigående^46,47, mens de kan holdes stabilt i grænsefladeregistreringskamre^10,48,49. Som sådan har mange undersøgelser af komplekse spontane aktivitet in vitro påberåbt grænseflade registrering kamre til at undersøge skarpe bølge krusning komplekser^{6,7,8,9,10,25,37}, gamma svingninger^10,13, og epileptiform aktivitet^16,38,45,47.

I et indspilningskammer i neddykket stil kan et mål for nedsænkningsmikroskop bruges til at visualisere individuelle celler og selektivt målrette sunde celler mod optagelser. Det nedsænkede præparat giver også fin kontrol over det cellulære miljø, da nedsænkning letter hurtig spredning af stoffer eller andre forbindelser til vævet. En ændret metode, hvor stabile netsvingninger opretholdes under neddykkede forhold, repræsenterer således en stærk eksperimentel tilgang. Denne fremgangsmåde er eksemplificeret ved arbejdet i Hájos et al., hvor hippocampal skiver inddrive i en forenklet interface-stil bedrift kammer i flere timer før overførsel til en modificeret nedsænket optagelse kammer med en høj strømningshastighed af ACSF (~ 6 mL/ min) for at øge iltforsyningen til vævet^12,48,49. Under disse omstændigheder kan høje niveauer af internuronaktivitet og stabile spontane netværkssvingninger opretholdes i et neddykket optagelseskammer. Denne ændrede tilgang gør det muligt for efterforskerne at udføre visuelt styrede helcelleplasterklemmeoptagelser og karakterisere bidraget fra morfologisk identificerede celletyper til carbachol-inducerede gammasvingninger¹². Stålwirer kan også forekomme spontant i neddykkede hippocampale skiver med en hurtig strømningshastighed på ACSF^11,48,49. Maier et al. påviste, at hippocampale skiver, der kom sig i et grænsefladekammer før overførsel til et nedsænket optagelseskammer pålideligt, udstillede spontane stålwirer, mens skiver, der kom sig nedsænket i et bægerglas før overførsel til et nedsænket optagelseskammer, viste mindre fremkaldte feltresponser, lavere niveauer af spontane synaptiske strømme og kun meget sjældent udstillede spontane^{SWR’er 43}. Schlingloff et al. anvendte denne forbedrede metode til at demonstrere parvalbumin-udtrykkende kurvcellers rolle i generering af spontane stålwirer⁴⁴.

Følgende protokol præsenterer en udskæringsmetode, hvorigennem spontant aktive neuroner i vandrette hippocampale skiver kan genvindes under grænsefladeforhold og efterfølgende opretholdes i et nedsænket optagelseskammer, der er egnet til farmakologiske eller optogenetiske manipulationer og visuelt styrede optagelser.