Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

A medição eletrofisiológica de fatias hipocampais vivas in vitro é uma abordagem experimental poderosa com inúmeras vantagens. O experimentador pode usar um microscópio, micromanipuladores e um sistema de gravação para visualizar e coletar diretamente medições de neurônios individuais no tecido. As fatias de tecido também são muito acessíveis à fotostimulação ou à entrega de medicamentos para experimentos optogenéticos, quimigênicos ou farmacológicos.

A rede hipocampal gera atividade populacional altamente síncrona in vivo,visível como oscilações no potencial de campo local extracelular^1,2,3,4,5. Os métodos de fatia cerebral foram aproveitados para obter uma visão dos mecanismos celulares e de circuito subjacentes a essas oscilações da rede neuronal. O trabalho fundamental de Maier et al. demonstrou que complexos de ondas acentuadas (SWRs) podem surgir espontaneamente em fatias do hipocampo ventral^6,7. Estudos subsequentes de múltiplos pesquisadores têm gradualmente elucidado muitos aspectos das SWRs, incluindo o papel dos neuromoduladores na regulação do estado de rede do hipocampo^8,9,10 e os mecanismos sinápticos que impulsionam a reativação in vitro de conjuntos neuronais anteriormente ativos durante o comportamento in vivo¹¹. Experimentos com fatias cerebrais também forneceram uma visão da oscilação da gama gama gama (30-100 Hz), um estado distinto da rede hipocampal que se acredita apoiar a codificação da memória e recordar^12,13. Finalmente, reconhecendo o papel central do hipocampo e das estruturas associadas na fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal^14,15, pesquisadores têm usado preparações de fatias hipocampais para investigar a geração e propagação da atividade epilépforme. Carter et al. demonstraram que fatias combinadas de córtex hipocampal-entorhinal preparadas a partir de animais cronicamente epilépticos podem gerar espontaneamente descargas epilépticas in vitro¹⁶. Posteriormente, Karlócai et al. exploraram os mecanismos subjacentes às descargas epilépformas em fatias hipocampais usando fluido cerebrospinal artificial modificado (ACSF) com concentrações de íons alteradas (Mg²⁺ ou K⁺elevados ) ou drogas adicionadas (4AP ou gabazina)¹⁷.

Os pesquisadores desenvolveram numerosas abordagens de fatias hipocampais que diferem de formas-chave: (1) a região do hipocampo contida na fatia (dorsal, intermediária ou ventral); (2) a presença ou ausência de tecidos extrahiptocampais, como o córtex entorhinal; (3) a orientação utilizada para cortar fatias (coronal, sagital, horizontal ou oblíqua); e (4) as condições sob as quais o tecido é mantido após o corte (submerso totalmente em ACSF ou mantido na interface do ACSF e ar umidificado, rico em carbogênio).

A escolha de qual abordagem de corte deve ser determinada pelo objetivo experimental. Por exemplo, fatias transversais ou coronais do hipocampo dorsal mantidas em condições submersas têm sido utilizadas de forma muito eficaz para a investigação de circuitos intrahipotecampal e plasticidade sináptica^18,19,20. No entanto, tais preparações não geram espontaneamente oscilações de rede tão facilmente quanto fatias do hipocampo ventral^21,22,23. Embora um estado de atividade SWR persistente possa ser induzido pela estimulação tetanica em fatias transversais do hipocampo dorsal e ventral²⁴, swRs espontâneos são mais facilmente observados em fatias ventrais^7,25.

Uma distinção fisiológica e anatômica inerente entre o hipocampo dorsal e ventral é apoiada por estudos realizados tanto in vivo quanto in vitro²⁶. Gravações em ratos revelaram ritmos de fortemente coerentes em todo o hipocampo dorsal e intermediário, mas com pouca coerência entre a região ventral e o resto do hipocampo²⁷. SWRs in vivo propagam-se prontamente entre o hipocampo dorsal e intermediário, enquanto os SWRs que se originam no hipocampo ventral permanecem frequentemente locais²⁸. As projeções associacionais originárias de neurônios piramimais ca3 que residem no projeto de hipocampo dorsal e intermediário a longas distâncias ao longo do eixo longitudinal do hipocampo. As projeções de CA3 originárias de regiões ventrais permanecem relativamente locais e, portanto, são menos propensas a serem cortadas durante o processo de corte^29,30. As fatias ventrais podem, portanto, preservar melhor a rede recorrente necessária para gerar sincronia populacional. A propensão de fatias ventrais para gerar atividades espontâneas de rede in vitro também pode refletir maior excitabilidade intrínseca de neurônios piramidários ou inibição mais fraca do hipocampo ventral em comparação com regiões mais dorsais³¹. De fato, as fatias hipocampais ventrais são mais suscetíveis à atividade epilépforme^32,33. Assim, muitos estudos de fisiológicas espontâneas^8,9,11,24 ou patológicos^16,34,35,36 oscilações de rede têm tradicionalmente utilizado uma abordagem de corte horizontal, às vezes com um leve ângulo na direção fronto-occipital, que produz fatias de tecido paralelas ao plano transversal do hipocampo ventral.

A conectividade de rede é inevitavelmente impactada pelo procedimento de corte, pois muitas células na fatia serão cortadas. O ângulo e a espessura da fatia e o tecido retido na preparação devem ser considerados para otimizar a conectividade nos circuitos de interesse. Muitos estudos utilizaram fatias horizontais combinadas de córtex hipocampal-entorhinal (HEC) para explorar interações entre as duas estruturas no contexto de oscilações fisiológicas ou patológicas da rede. Roth et al. realizaram gravações duplas do subcampo CA1 do hipocampo e da camada V do córtex entorhinal medial para demonstrar a propagação da atividade SWR através da fatia HEC³⁷. Muitos estudos de atividade epilepiforme têm utilizado a preparação da fatia hec para investigar como as descargas epilépformes se propagam através da rede corticohippocampal^16,35,36,38. É importante notar que a preservação do laço corticohippocampal intacto não é um pré-requisito para SWRs espontâneos, descargas epilépticas ou oscilações gama; oscilações de rede podem ser geradas em fatias transversais do hipocampo dorsal ou ventral sem tecidos parahiptocampais anexados^{21,22,23, 25,39,40,41}. Um fator mais importante para a geração espontânea de oscilações de rede em fatias hipocampais pode ser a espessura de cada fatia, pois uma fatia mais grossa (400-550 μm) preservará mais conectividade na rede recorrente CA2/CA3^21,22,25.

Embora as fatias de HEC horizontais angulares (cortadas com ângulo de aproximadamente 12° na direção fronto-occipital) tenham sido utilizadas para estudar a conectividade funcional do laço corticohippocampal^{11,16,34,35,42}, tais preparações angulares não são necessárias para a atividade espontânea da rede^43,44,45. No entanto, o uso de um plano de corte angular permite ao investigador fazer seletivamente fatias que melhor preservem o lamellae transversalmente orientado do hipocampo ventral ou intermediário, dependendo se um ângulo para baixo ou para cima é aplicado(Figura 1). Esta abordagem é conceitualmente semelhante à usada por Papatheodoropoulos et al., 2002, que dissecou cada hipocampo livre e depois usou um helicóptero de tecido para criar fatias transversais ao longo de todo o eixo dorsal-ventral²¹. À luz das distinções funcionais acima mencionadas entre o hipocampo ventral e dorsal-intermediário, os pesquisadores devem considerar a origem anatômica das fatias ao projetar experimentos ou interpretar resultados. O uso de uma rampa de ágar durante o procedimento de corte é uma maneira simples de produzir preferencialmente fatias do hipocampo intermediário ou ventral.

As fatias hipocampais podem ser mantidas em uma câmara submersa (com o tecido totalmente imerso em ACSF), ou em uma câmara de estilo interface (por exemplo, câmara de Oslo ou Haas, com fatias cobertas apenas por uma fina película de mídia fluindo). A manutenção da interface aumenta a oxigenação do tecido, o que promove a sobrevivência neuronal e permite altos níveis sustentados de atividade interneuronal. Tradicionalmente, as condições de gravação submersas utilizam uma taxa de fluxo ACSF mais lenta que não fornece oxigenação adequada do tecido para uma expressão estável de oscilações em nível de rede. Em fatias hipocampais submersas, as oscilações gama induzidas por carbachol são observadas apenas transitoriamente^46,47, enquanto podem ser mantidas de forma estável nas câmaras de gravação de interface^10,48,49. Como tal, muitos estudos de atividade espontânea complexa in vitro têm se apoiado em câmaras de gravação de interface para investigar complexos de ondas agudas^{6,7,8,9,10,25,37}, oscilações gama^10,13, e atividade epilépforma^16,38,45,47.

Em uma câmara de gravação de estilo submerso, um objetivo de microscópio de imersão pode ser usado para visualizar células individuais e direcionar seletivamente células de aparência saudável para gravações. A preparação submersa também permite um bom controle sobre o meio celular, pois a submersão facilita a rápida difusão de drogas ou outros compostos para o tecido. Assim, uma metodologia modificada na qual as oscilações estáveis da rede são mantidas em condições submersas representa uma abordagem experimental poderosa. Esta abordagem é exemplificada pelo trabalho de Hájos et al., no qual as fatias hipocampais se recuperam em uma câmara de retenção simplificada no estilo interface por várias horas antes da transferência para uma câmara de gravação submersa modificada com uma alta taxa de fluxo de ACSF (~6 mL/min) para aumentar o fornecimento de oxigênio ao tecido^12,48,49. Nessas condições, altos níveis de atividade interneuron e oscilações estáveis da rede espontânea podem ser mantidos em uma câmara de gravação submersa. Esta abordagem modificada permite que os pesquisadores realizem gravações de grampos de remendo de células inteiras visualmente guiadas e caracterizem a contribuição de tipos de células morfologicamente identificadas para as oscilações gama induzidas por carbachol¹². SwRs também podem ocorrer espontaneamente em fatias hipocampais submersas com uma taxa de fluxo rápida de ACSF^11,48,49. Maier et al. demonstraram que as fatias hipocampais que se recuperaram em uma câmara de interface antes da transferência para uma câmara de gravação submersa exibiam de forma confiável SWRs espontâneas, enquanto as fatias que se recuperavam submersas em um béquer antes da transferência para uma câmara de gravação submersa apresentaram respostas de campo evocadas menores, níveis mais baixos de correntes sinápticas espontâneas, e apenas muito raramente exibiam SWRs espontâneos⁴³. Schlingloff et al. utilizaram essa metodologia aprimorada para demonstrar o papel das células cestos expressas por parvalbumin na geração de SWRs^{espontâneas 44}.

O protocolo a seguir apresenta um método de corte através do qual neurônios espontaneamente ativos em fatias hipocampais horizontais podem ser recuperados em condições de interface e posteriormente mantidos em uma câmara de gravação submersa adequada para manipulações farmacológicas ou optogenéticas e gravações visualmente guiadas.