Biyomacrooleküllerin kristalografi ile yapısal çalışmaları yüksek kaliteli kristaller gerektirir. Burada OptiCrys (laboratuvarımızda geliştirilen tam otomatik bir cihaz) ve/veya mikrodiyaliz düğmeleri tarafından kristalizasyon faz diyagramı bilgisine dayanarak büyük yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanılabilecek bir protokol gösteriyoruz.
Nötron makromoleküler kristalografinin (NMX) kullanımı, inşa edilen yeni NMX kiriş hatları ve yapı iyileştirme yazılımının kullanılabilirliğinin artması sayesinde son on yılda belirlenen çoğu yapıyla hızla genişliyor. Bununla birlikte, şu anda NMX için mevcut olan nötron kaynakları, X-ışını kristalografisi için eşdeğer kaynaklardan önemli ölçüde daha zayıftır. Bu alandaki gelişmelere rağmen, nötron kırınım çalışmaları için, özellikle de daha büyük makromolekülleri ve kompleksleri inceleme eğilimi ile her zaman önemli ölçüde daha büyük kristaller gerekecektir. Bu nedenle, NMX’in genişlemesi için daha büyük kristaller yetiştirmeye uygun yöntemler ve enstrümantasyonda daha fazla iyileştirme yapılması gerekir.
Bu çalışmada, laboratuvarımızda geliştirilen ve mikroskopla monte edilmiş bir video kamera aracılığıyla gerçek zamanlı gözlemi kristalizasyon çözeltilerinin hassas otomatik kontrolüyle (örneğin, çökelti konsantrasyonu, pH, katkı maddesi, sıcaklık) birleştiren rasyonel stratejiler ve bir kristal büyüme tezgahı (OptiCrys) sunuyoruz. Daha sonra bu sıcaklık ve kimyasal bileşim kontrolünün model çözünür proteinleri kullanarak optimum kristalizasyon koşullarının aranmasını nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Kristalizasyon faz diyagramı hakkında kapsamlı bilgi, herhangi bir kristalizasyon deneyi için başlangıç konumunu ve kinetik yolu seçmek için çok önemlidir. Rasyonel bir yaklaşımın, çok boyutlu faz diyagramlarının bilgisine dayanarak üretilen kristallerin boyutunu ve sayısını nasıl kontrol edebileceğini gösteriyoruz.
Proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisini ve fizyolojik yolların mekanizmasını anlamak genellikle hidrojen atomlarının (H) konumlarını ve yükün bir protein içinde nasıl aktarıldığınıbilmeyedayanır1,2. Hidrojen atomları X ışınlarını zayıf bir şekilde dağıttığından, konumları sadece çok yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınım verileri (>1 Å)3,4ile belirlenebilir. Tersine, nötron kristalografisi hidrojen ve döteryum (H2,hidrojen izotopu) atomlarının oksijen, azot ve karbon5olarak kabaca eşit büyüklükte saçılma uzunluklarına sahip olması nedeniyle biyolojik makromoleküllerde hidrojen atomlarının doğru bir konumunu elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mevcut nötron kaynaklarından gelen nötron akısı X-ışını ışınlarından daha zayıftır, bu nedenle bu genellikle2,3için telafi edilmelidir. Bu, H2 ile H alışverişi ve / veya hidrojenlerin tutarsız saçılmasını azaltmak ve kırınım görüntülerinin sinyal-gürültü oranını artırmak için kristallerin hacmini artırarak elde edilebilir.
Hem X-ışını hem de nötron biyo-makromoleküler kristalografi için büyük ve yüksek kaliteli kristaller elde etmek için çeşitli kristalleşme yaklaşımları vardır (ilgili şematik faz diyagramı Şekil 1’degösterilmiştir6. Buhar difüzyonunda, bir protein ve kristalizasyon çözeltisinin karışımından hazırlanan bir damlacık, zaman içinde, su veya diğer uçucu türlerin buharlaşması yoluyla, aynı kristalizasyon çözeltisinin daha yüksek bir çökelti konsantrasyonunu içeren bir rezervuara karşı denge edilir. Damlacıktaki protein ve çökelti konsantrasyonundaki artış, spontan çekirdeklenme için gerekli olan aşırı doyma ve ardından bu çekirdeklerde kristal büyümesine yol açar6,7. Buhar difüzyonu kristal yetiştirmek için en sık kullanılan teknik olmasına rağmen4, kristalizasyon işlemi tam olarak kontrol edilemez8. Serbest arayüz difüzyon yönteminde, kristalizasyon çözeltisi konsantre bir protein çözeltisine yayılır ve sistemi çok yavaş bir şekilde aşırı doygunluğa yönlendirir. Bu yöntem, yavaş karıştırma hızı6, 9 , 10,11,12olan bir toplu iş yöntemi olarak düşünülebilir. Parti yönteminde, protein hızla aşırı doymaya yol açan bir kristalizasyon çözeltisi ve buna karşılık birçok kristal ile tekdüze çekirdeklenme ile karıştırılır3,7. Bu yöntem, şu anda Protein Veri Bankası’na yatırılan tüm yapıların yaklaşık üçte birini oluşturmuştır. Diyaliz yöntemi aynı zamanda yüksek kaliteli ve iyi dağınık protein kristalleri yetiştirmek için de kullanılır. Diyaliz yönteminde, çökelti molekülleri bir rezervuardan yarı geçirgen bir membrandan protein çözeltisi ile ayrı bir odaya yayılır. Denge kinetiği sıcaklık, membran gözenek büyüklüğü ve protein örneklerinin ve kristalizasyon ajanlarının hacmi ve konsantrasyonu gibi çeşitli faktörlere bağlıdır6.
Kristalizasyon faz diyagramları, bir proteinin farklı durumlarını farklı fiziksel veya kimyasal değişken3’ünbir işlevi olarak tanımlamak için kullanılabilir. Şekil 1’degösterildiği gibi, her kristalizasyon tekniği, böyle bir diyagram6, 10,13’ünçekirdeklenme ve metastable bölgelerine ulaşmak için farklı bir kinetik yörünge kullanılarak görselleştirilebilir. Bu, protein çözünürlüğü ve kristal ile çözelti arasındaki termodinamik dengenin gözlendiği protein konsantrasyonu hakkında bilgi sağlar, böylece çekirdeklenme ve büyüme için en uygun koşulları bulur3,14. İki boyutlu faz diyagramında, protein konsantrasyonu bir değişkenin işlevi olarak çizilir ve diğer değişkenler sabit tutulur15. Böyle bir faz diyagramında, protein konsantrasyonu çözünürlük eğrisinin altında olduğunda, çözelti az doymamış bölgededir ve çekirdeklenme veya kristal büyümesi gerçekleşmez. Bu eğrinin üzerinde, protein konsantrasyonunun çözünürlük sınırı3,14’tendaha yüksek olduğu aşırı doyma bölgesi vardır. Bu daha sonra üç bölgeye ayrılır: metastable bölge, spontan çekirdeklenme bölgesi ve yağış bölgesi. Metastable bölgede, aşırı doyma, çekirdeğin makul bir süre içinde gerçekleşmesi için yeterli değildir, ancak tohumlu kristallerin büyümesi gerçekleşebilir. Aşırı doymanın çok yüksek olduğu yağış bölgesinde toplama ve yağış tercih edilir14,15.
Spontan çekirdeklenme için yeterli aşırı doyma sağlandığında, ilk çekirdek10görünecektir. Kristallerin büyümesi, çözünürlük sınırına ulaşılana kadar protein konsantrasyonunda bir azalmaya yol açar. Aşırı doyma, çözünürlük eğrisinin yakınında kaldığı sürece, kristallerin boyutunda önemli bir değişiklik olmayacaktır. Bununla birlikte, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklığındaki ve kimyasal bileşimindeki varyasyonların (örneğin, çökelti konsantrasyonu) protein çözünürlüğünü etkileyeceği ve daha fazla kristal büyümesinin başlatılmasına yol açabileceği gösterilmiştir8,13,16.
Diyaliz kaliteli kristal büyümesi için avantajlı olduğundan, Şekil 2’degösterilen OptiCrys kristalizasyon tezgahı, kristalleşmeyi tam otomatik bir şekilde kontrol etmek için laboratuvarımızda tasarlanmış ve geliştirilmiştir8. Bu amaçla LabVIEW ile Peltier elemanları ile temas halinde akan rezervuar diyaliz kurulumunun sıcaklığının elektronik kontrolör ve soğutucu aracılığıyla kontrol ve izlenmesini sağlayan bir yazılım yazılmıştır. Aynı yazılım ayrıca çok kanallı akışkan bir sistem kullanarak kristalizasyon çözeltisinin kimyasal bileşimini (örneğin kristalizasyon ajanlarının değişimi) otomatik olarak düzenler. Ayrıca, kristalizasyon işlemini görselleştirmek ve kaydetmek için dijital kamera ve ters mikroskop kullanılır. Farklı amaçlar için kristal yetiştirmek için 15 μL ve 250 μL hacimli iki kristalizasyon odası mevcuttur. Kristalizasyon işlemi tersine çevrilebilir olduğundan, numune zarar görmediği sürece protein çözeltisinin sadece birkaç mikrolitresi ile farklı koşullar için tarama mümkündür8. Sonuç olarak, bu yöntemin kullanılması kullanılan protein malzemesi miktarını en aza indirir.
Önceki çalışmalardan8Kristal büyüme sürecinde, yerinde gözlemlerin düzenli zaman aralıklarında yapılması gerektiği açıktır. Bunlar, gözlem altındaki olaya (yağış, çekirdeklenme veya kristal büyümesi) bağlı olarak birkaç saniye ile birkaç gün arasında değişebilir.
OptiCrys ile kristal büyümesinin optimizasyonu, sıcaklık çökeltisi konsantrasyon fazı diyagramlarına dayanmaktadır. Sıcaklığın doğrudan bir işlevi olarak çözünürlüğe sahip proteinler söz konusu olduğunda, tuzlama rejiminden yararlanmak mümkündür18. Bu, protein-çökağan faz diyagramları kullanılarak görselleştirilebilen çözeltinin iyonik gücünün artırılmasının proteinin çözünürlüğünü azalttığı yerdir. Aynı şekilde, ters çözünürlüğe sahip proteinler tuzlama rejiminden yararlanabilir18. Çekirdeklenme çekirdeklenme bölgesinde, metastable bölgesinin yakınında gerçekleşir ve kristal büyümesi daha sonra protein konsantrasyonu çözünürlük sınırına ulaşana kadar faz diyagramının metastable bölgesinde gerçekleşir. Şekil 3A’dagösterildiği gibi, yeni çekirdeklenmeyi önlemek için kristalizasyon çözeltisini metastable bölgede tutmak için sabit kimyasal bileşim sıcaklığı azaltılabilir. Kristaller ikinci kristal/çözelti dengesi elde edilene kadar büyür ve bundan sonra kristallerin boyutunda daha fazla artış gözlenmez. Kristaller istenen boyuta ulaşana kadar sıcaklık birkaç kez azalır. Şekil 3B‘de , sabit sıcaklıkta, çökelti konsantrasyonu arttırılması çözeltiyi metastable bölgesinde tutar. Bu işlem daha sonra büyük kristaller elde etmek için birkaç kez tekrarlanabilir. Sıcaklığı değiştirmek ve kristalizasyon çözüm koşullarını manipüle etmek, aşırı doyma seviyelerini kontrol ederek, OptiCrys 5,8,14tarafındantam ve otomatik olarak kontrol edilen kristallerin çekirdeklenme ve büyümesini ayırmak için iki güçlü araçtır.
Literatürde ve PDB’de sıcaklık kontrollü veya sıcaklık ve çökelti konsantrasyon kontrollü kristalleşme ile yetiştirilen protein kristallerinin yanı sıra elde edilen göreceli kırınım verileri örnekleri mevcuttur. Bunlar arasında insan γ-kristalin E, PA-IIL lectin, maya inorganik pirofosfataz, ürat oksidaz, insan karbonik anhidraz II, YchB kinaz ve laktat dehidrogenaz5,14,17,18bulunmaktadır.
OptiCrys NatX-ray ile ticarileştirilmiş olsa da, bu cihaza veya sunduğu seri yaklaşıma erişimi olmayan birçok laboratuvar vardır. Bu tekniğin alternatifi, çeşitli hacimlerde ticari olarak kullanılabilen plastik mikrodiyaliz düğmelerini kullanmaktır. Bunları kullanarak, sıcaklık ve kimyasal bileşim manuel olarak ayarlanabilir ve değiştirilebilir. Mikrodiyaliz düğmelerinin muayenesi yerinde yapılamaz ve bunun yerine optik mikroskopla manuel olarak yapılmalıdır. Numuneyi titreşimsiz sıcaklık kontrollü bir inkübatörde tutarak sıcaklık kontrolü sağlanabilir. Kristalizasyon deneylerinin tekrarlanabilir olmasını sağlamak için sıcaklığı sabit tutmak önemlidir. Sıcaklıktaki önemli değişim kristallerin zarar görmesine veya tahrip olmasına da neden olabilir5.
Burada, nötron protein kristalografisi için uygun büyük, yüksek kaliteli kristallerin büyümesi için numune hazırlama ve kontrol yazılımının kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu adım adım prosedür, oluşturulan kristallerin boyutunu ve kalitesini kontrol etmek için bir başlangıç pozisyonu ve kinetik yol seçmek için kristalizasyon faz diyagramından yararlanmak için tasarlanmıştır. Ek olarak, büyük, yüksek kaliteli kristaller elde etmek için aynı mantığı kullanan mikrodiyaliz düğmeli kristallerin yetiştirilmeleri için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Farklı fiziksel, kimyasal ve biyolojik değişkenler protein çözünürlüğü etkileyerek protein kristalizasyonunu etkiler21. Bu değişkenler arasında, kristalizasyon çözeltisinin sıcaklık ve kimyasal bileşimi, nötron kırınım çalışmaları için biyomacrooleküllerin büyük yüksek kaliteli kristallerini iyileştirmek ve büyütmek için diyaliz tekniği ile birlikte kullanılmaktadır. Faz diyagramları bilgisi kullanılarak kristalizasyon daha öngörülebilir hale getirilir. Farklı kristalleşme koşullarının seri bir yaklaşımla taranması da mümkün olsa da, sunulan rasyonel yaklaşımların kullanılmasının temel amacı kristal çekirdeklenme ve büyümenin kinetiğini ayırmak ve kontrol etmektir.
Tüm kristalizasyon çalışmalarına benzer şekilde, yüksek kaliteli saf ve homojen protein örnekleri ve tozsuz kristalizasyon çözümleri deneyin başarı oranını arttırır. Çözümlerin filtrasyonu ve santrifüjlenmesi, açıklanan protokollerde önemli adımlardır. Moleküler ağırlık (uygun diyaliz zarını seçmek için), izoelektrik nokta ve protein çözünürlüğü gibi çalışılan proteinlerin fizikokimyasal özelliklerini bilmek, optimal bir kristal büyüme deneyinin tasarımı için çok önemlidir. Ayrıca, numune kaybını önlemek ve başarı olasılığını artırmak için farklı sıcaklıklarda veya farklı kimyasallarla protein stabilitesi için dikkate alınmalıdır. OptiCrys’in sıcaklık aralığı (233.0–353.0 ± 0.1 K) göz önüne alındığında, çok çeşitli proteinler kullanılarak kristalize edilebilir. Ancak, termofilik kaynaklardan elde edilen proteinler gibi öncelikle termo-stabil olan proteinlerin, bu cihaz tarafından sunulan sıcaklık kontrollü büyük hacimli kristal büyüme deneylerinde en çok fayda sağlayacağını vurgulamak gerekir.
Düşük hacimli bir diyaliz odası (OptiCrys kullanırken) veya mikrodiyaliz düğmeleri kullanarak ve çeşitli sıcaklıkları ve kristalizasyon koşullarını (örneğin, çökelti konsantrasyonu veya pH ızgaraları) tararken, metastable bölgenin sınırının (çekirdeklenme ve metastable bölgeler arasındaki kinetik denge) yeri hakkında bilgi edinmek mümkündür. Bu, özellikle kristalizasyonda yeni protein adayları için başarılı bir kristal büyüme deneyi tasarlarken paha biçilemez. Bu bilgi olmadan deneyler, kristal çekirdeğini kolayca kontrol etmek için metastable bölgenin sınırından çok uzak, yüksek doymamışlık ile faz diyagramının bir alanından başlayabilir. Protein çökeltisinin çözünmesine çalışılsa da, örneğin doğrudan çözünürlük durumunda sıcaklığı artırarak, termositesi azaltılmış proteinler için, numuneyi daha uzun süre yüksek sıcaklıkta tutmak protein çökeltmesini geri döndürülemez hale getirebilir. Bu nedenle, en iyi strateji, çekirdeklenmenin kontrol edilebildiği ve protein yağışının önlenebileceği metasabiliyet sınırına yakın bulunan daha düşük aşırı doymalı bir başlangıç koşulu kullanmaktan oluşur. Bu doğrultuda kristalizasyon önscreeningi diyaliz odasında protein çökeltme şansını azaltır ve deneyin başarı oranını artırır.
Bir deney tasarladıktan sonra, diyaliz odaları (OptiCrys) veya mikrodiyaliz düğmeleri hazırlamak bir başka önemli adımdır. Diyaliz haznesinde/butonunda hava kabarcığı oluşumunun önlenmesi özellikle küçük hacimler kullanıldığında başarılı kristalleşme şansını artırır. Diyaliz odasında hava kabarcıklarının varlığı da kristalleşme sürecinin kinetiğini değiştirebilir ve deneyin tekrarlanabilirliğini azaltabilir (çünkü protein/ çözelti temas yüzeyi değiştirilmiştir). Sadece protein değil, kristalizasyon çözeltisi de deneyin başarısını etkileyebilir. Her deneyden sonra pompalama sistemi için yeni 50 mL tüpler kullanmak ve her deneyden sonra boru yıkamak, kontaminasyon olasılığını azaltır ve aparatta tuz kristallerinin oluşturulmasını önler.
OptiCrys mevcut olmadığında mikrodiyaliz düğmelerinin kullanımı bir alternatiftir. Yukarıda belirtilen kristalizasyonu optimize etme ve kristal büyümesini izleme stratejileri manuel olarak gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak bu, sıcaklık düzenlemesi açıklanan metodolojide kritik bir adım olduğunda sorunlu olabilen bir termoregülasyonlu inkübatörün dışında olmayı gerektirir. Bu, kristalizasyon çözeltilerinin kimyasal bileşimini değiştirmeyi veya kristal büyümesini görüntüleme ile izlemeyi kolaylaştırmaz, bu nedenle kristal büyüme süreci gerçek zamanlı olarak kontrol edilemez.
Faz diyagramının bilgisi, kristalizasyon tezgahı OptiCrys’i otomatik bir şekilde sistematik olarak büyük, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kullanmanın temelidir. Kristalizasyon sırasında sıcaklık, çökelti konsantrasyonu ve pH gibi fizikokimyasal parametrelerin kontrolü, protein çözeltisi dengesini faz diyagramında iyi tanımlanmış bir kinetik yörüngede hareket ettirir. Bu, kütle taşımacılığını ayarlamak ve kristalizasyon odasında kristallerin boyutunu ve kalitesini etkileyen kontrollü bir gradyan oluşturmak için bir diyaliz zarının kullanılmasıyla tamamlanır. Bu nedenle, hem termodinamik verileri hem de kinetik yörüngeleri kullanmak, yüksek kaliteli kristaller yetiştirmek için kristalleşme sürecini kontrol etmek için gereklidir. OptiCrys sayesinde, çok boyutlu bir alandaki sistematik faz diyagramları, öncekinden önemli ölçüde daha az malzeme kullanılarak seri bir yaklaşımla incelenebilir. Bu metodolojiyi göstermek için, burada bir model protein, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme ile bir vaka çalışması sunuyoruz. Burada sunulan protokolü kullanarak ve ustalayarak gerçek proteinsistemlerineuyarlayabilir 5,14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
MBS, LABEX VALO GRAL’ın 2015 sözleşmesi kapsamındaki desteğini kabul etmektedir. NJ, Doktora Bursu için CEA’nın Uluslararası Doktora Araştırma Programını (Irtelis) kabul eder. Yazarlar, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması olan 722687 kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı’ndan fon sağladığını kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca yardımcı konuşmalar ve içgörüler için Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) ve Dr Jean-Luc Ferrer’e (IBS, Grenoble) minnettardır. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü’ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder.
200 µl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-330 | Dialysis button |
24 well plates | Jena Bioscience | CPL-132 | Crystallization plate |
2-Switch | FLUIGENT | 2SW001 | Switch |
30 μl Dialysis Button | Hampton Research | HR3-324 | Dialysis button |
50 mL Corning Centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828-500EA | Centrifuge tubes |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | S2889 | Chemical |
Chicken Egg White Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Lyophilized protein powder |
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132478 | Dialysis membrane |
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO | Spectrum | 132650T | Dialysis membrane |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin | Bench-top centrifuge |
Flow Unit | FLUIGENT | FLU-XL | Flow meter |
Flowboard | FLUIGENT | FLB | Flowboard |
Microfluidic Flow Control System EZ | FLUIGENT | EZ-01000002 | Pressure/vacuum controller |
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters | Millipore | GSWP04700 | 0.22 μm pore size filter |
M-Switch | FLUIGENT | MSW002 | Rotary valve |
Opticrys | NatX-ray | PRT008 | Crystallization bench |
Siliconized circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Glass slides |
Sodium Chloride ≥ 99% | Sigma-Aldrich | 746398 | Chemical |
Switchboard | FLUIGENT | SWB002 | Switchboard |
Thermoregulated incubator | Memmert | IPP30 | Thermoregulated incubator |