중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

1. 미세 투석 버튼투석 방법 샘플 준비 최종 농도30mg/mL-1의 용액을 얻기 위해CH3COONa 버퍼(100mM 나트륨 아세테이트, pH 4)의 1mL에서 리오필화 된 분말로 닭고기 달걀 흰자 리소지메 30 mg을 용해시켜 단백질 용액을 준비한다. 원심 분리기는 277 K에서 10 분 동안 13,000 × g에서 샘플을 원심 분리합니다. 이 프로세스는 결정화 프로세스를 시작하기 전에 모든 집계를 제거하는 데 도움이 됩니다. 280 nm에서 샘플의 흡광도를 확인하고 맥주 램버트 방정식 (A = θcl)을 사용하여 단백질 농도를 계산합니다.참고: 맥주-램버트 방정식에 따르면, 전자 흡광도(A)는 일정한 광학 경로길이(l, cm)를 부여한 흡수 종의 농도(c,mg·mL-1)에직접 비례한다. 이 선형 관계의 그라데이션은 어금니 소멸 계수(ε, 280nm에서 리소지메의 경우 2.64mL/mg-1·cm-1)19이다. 방향족 아미노산 (티로신, 트립토판 및 페닐알라닌)과 시스테인 잔류물 사이의 이황화 결합의 사이드 체인은 분광 허용 π 발생 ~ 280 nm에서 강한 흡수성을 가지고 – π * 전환. 단백질의 대다수가 이러한 잔류물을 포함하기 때문에, 단백질 농도는 전형적으로 멸종 계수에 대한 지식을 감안할 때 280 nm에서 흡광도를 측정하여 쉽게 계산될 수 있다. 도 4에도시된 바와 같이 결정화 솔루션을 준비한다. 결정화 용액을 준비하기 전에 0.22 μm 밀리포어 필터로 모든 스톡 솔루션을 필터링합니다. 크리스탈 성장 적절한 분자량 차단(6-8 kDa)으로 셀룰로오스 투석 막을 자르고 증류수에 담급니다.참고: 투석막 디스크는 미세 투석 버튼에 상용화되어 있지만 투석 튜브를 사용하는 경우 두 층의 멤브레인을 튜브에서 분리하여 단일 층 멤브레인만 가지도록 가장자리를 자르는 것을 잊지 마십시오. 도 4에표시된 것과 동일한 순서로 결정화 용액 2mL로 24웰 트레이의 웰을 채우는 다.참고: 볼륨이 큰 버튼(예: 200 μL)을 사용하는 경우 효율적인 교환을 위해 최소 5mL 결정화 솔루션으로 50mL 튜브를 채웁니다. 그림 5A에도시된 바와 같이 마이크로투아실 버튼의 챔버에 리소지메 용액의 피펫 35 μL을 추가한다.참고: 30 μL 투석 버튼에서 기포가 형성되는 것을 피하려면 5μL의 추가 단백질을 추가해야 하며, 이는 총 35μL의 단백질 시료를 의미합니다. 이 추가 단백질 샘플은 기포의 형성을 방지하는 도 5B에도시된 바와 같이 챔버 위에 약간 돔형 모양을 만듭니다. 적절한 크기의 어플리케이터를 가지고 탄성 O 링을 극단(도 5C)에놓습니다. 그런 다음 이전에 가볍게 닦아 / 투석 버튼의 챔버 위에 섬유가없는 종이 조각을 사용하여 배수 멤브레인을 놓습니다. 용지를 적용할 때 챔버에 먼지를 넣지 않도록 주의하십시오. 투석버튼(도 5C)의홈으로 어플리케이터에서 탄성 O-링을 이송하여 투석 막을 제자리에 놓는다.참고: 처리의 중요한 순간은 어플리케이터에서 투석 버튼의 홈으로 탄성 O 링을 전송하여 챔버 위에 투석 막을 고정하는 것입니다. 모든 움직임은 단백질 챔버의 샘플과 기포를 둘러싸는 것을 피하기 위해 완벽하게 동기화되어야합니다. 그것의 강성을 알고, 그것의 응용 프로그램 하는 동안 멤브레인의 일부를 잡고 모델 단백질과 첫 번째 테스트 실험을 수행 하는 핀셋을 사용 하 여 그것의 강성을 알고 그것의 응용 프로그램 전에 탄성 O-링을 스트레칭 연습 하는 것이 유용 하다. 핀셋(도5D)을사용하여 버튼을 우물 또는 50mL 튜브로 전송합니다. 커버슬립으로 웰을 덮고, 그리스에 부드럽게 눌러 우물을밀봉합니다(그림 5E).참고: 우물 위에 기름이 없는 경우 실험을 시작하기 전에 이 것을 추가하거나 유리 커버슬립 대신 테이프를 사용해야 합니다. 미세 투석 버튼을 사용하여 단백질 결정화의 원리는 도 5에도시된다. 열조절인인293K에서 샘플을 보관하십시오. 사용되는 단백질 및 결정화 조건에 따라 다른 온도가 필요할 수 있습니다.참고: 도 4에 도시된 결정화 조건의 동일한 그리드(침전제의 농도가 다양하도록 허용)는 온도의 함수로서 스크리니션될 수 있다. 이 경우 동일한 결정화 플레이트를 재현해야 하며 각 복사본을 다른 온도로 조절하는 인큐베이터에 배치해야 합니다. 이를 위해서는 진동이 없는 열조절인이 몇 개 있어야 합니다. 트레이 나 튜브를 확인(그림 4)각 트레이에 있는 것을 구별하기 위하여, 일반적으로 매일, 매일, 정기적으로 메모를 하십시오. 좋은 노트는 거짓 긍정적 인 결과를 피하고 결정에서 먼지를 구별하는 데 필수적입니다. 2. OptiCrys를 사용하여 크리스탈 성장 프로세스 샘플 준비 섹션 1.1에 설명된 바와 같이 단백질 용액및 투석 막을 준비한다. NaCl(4M)과 CH3COONa pH 4(1M)의 스톡 솔루션을 준비하고 50mL 튜브로 필터링합니다. 단백질 용액(30mg·mL-1을가진 리소지메 15μL)를 온도 조절 유동 저수지 투석 설정의 투석챔버에 넣습니다. 온도 제어 흐르는 저수지 투석 설정에 대한 자세한 내용은 그림 6을 참조하십시오. OptiCrys는 두 개의 투석 챔버를 가지고 있으며, 최소 부피는 15 μL이고 최대 부피는 250 μL입니다. 투석 막으로 챔버를 덮고 탄성 O 링(도 6B)으로멤브레인을 고정합니다.참고: 이 설정은 각 챔버가 투석 막에 의해 직접 밀봉되는 미세 투석 버튼과 다릅니다. 유동 셀에서 투석 막은 대신 오버 챔버에 고정되어 제거하지 않고 결정의 장착을 허용합니다. 이를 위해 오버챔버는 단순히 저수지에서 풀려나일 수 있습니다. 상공 을 뒤집어 투석 챔버 위에 놓습니다. 천천히 부드럽게 눌러 두 조각 사이에 갇힌 모든 공기를 제거하고 챔버(도 6C)에서거품을 피하십시오. 모델 단백질을 이용한 연습은 기포와 시료 손실을 피하기 위해 훈련할 때 유리할 수 있다. 저수지를 오버챔버 위에 부드럽게 나사로 고정하고, 다시 한 번 기포를 포획하지 않도록 염두에 두십시오. 저수지의 과다 체결은 결정화챔버(도 6D)에서기포를 형성할 수도 있다. 결정화 용액을 추가하고 밀폐 캡으로 저수지 챔버를 덮습니다. (그림6G). 저수지의 최대 부피는 1mL입니다. 이 어셈블리를 전송하여 황동 지지대에 삽입합니다. 이 지원은 온도를 제어하는 데 사용되는 Peltier 요소와 접촉합니다. 도 6에도시된 바와 같이, 밀폐캡에는 투석실의 최고 조명을 허용하는 광학 창이 장착되어 있습니다. 빛이 챔버를 통과할 수 있도록 창에 광원(도2)을놓습니다. 저수지 챔버는 펌프에 연결하여 연속 유동 셀로 작동할 수 있습니다. 도 7에도시된 바와 같이 스톡 솔루션과 증류수를 포함하는 50mL 튜브 위에 튜브를 로터리 밸브에 연결합니다.참고: 실험 중에 결정화 솔루션의 자동 준비 및 변경이 필요하지 않은 경우 2.1.10 단계를 생략합니다. 이 경우 결정화 용액을 준비해야 하며 저장소를 수동으로 미리 채우어야 한다. 소프트웨어 컴퓨터를 켜고 소프트웨어 크로아산 스크탤린 [크리스탈 성장]을시작합니다. 이 제어 소프트웨어는LabVIEW(http://www.ni.com/labview/)로작성되었으며 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스를 제공합니다. 그것은 포함 4 다른 그래픽 인터페이스(Accueil [환영], 파라메토리 [설정], Essai [테스트], 유지 보수 [유지 보수])(그림 8).참고: 프랑스어번역은 괄호안에 있습니다. 그림 8에표시된 대로 단추를 클릭하여 유지 관리 보기를 선택합니다. 이 보기는 현재 가장 자주 사용되며 사용자가 실험 중에 대부분의 매개 변수를 제어할 수 있습니다.참고: 유지 관리 뷰를 클릭하면 온도 또는 라이트와 같은 매개 변수를 제어하기 위한 섹션이 다른 새 창이 나타납니다. 그림 8에서 이 뷰의 다른 부분은 화살표와 프레임으로 표시됩니다. 다음 단계에서는 소프트웨어를 사용하여 각 매개 변수를 제어하는 방법을 보여 줍니다. 레굴라투르 드 템페레투르 [온도 컨트롤러] 섹션은 온도를 제어하고 모니터링할 수 있습니다. 그림 8의버튼 1(1)을 클릭하여 켭니다.참고: OptiCrys의 온도 범위는 233.0 ~ 353.0 ± 0.1 K입니다. 위탁 [setpoint] 섹션에 온도를 설정하고 enter기(그림8(2).. 이 단추 아래에는 2개의 추적(빨간색과 노란색)이 있는 그래프가 있습니다. 빨간색 추적은 최종(정렬된) 온도를 표시하고 노란색 추적은 현재 온도를 표시합니다. 도 8(2)에도시된 바와 같이, 온도는 20°C로 설정된다.참고: 크리스탈 성장 구간에서 설명한 대로 크리스탈을 성장시키기 위해서는 많은 온도를 선택해야 합니다. 온도를 변경하려면 위탁 [setpoint] 섹션에 새 온도를 각각 추가하고 키보드의 Enter 버튼을 누릅니다. 그림 8의 Lumières [조명] 섹션에서 광도를 높여 빛을 켭니다. 광도는 0에서 100까지, “0”은 빛이 꺼지고 “100”에서 빛이 강도와 밝기의 최대로 설정되어 있음을 나타냅니다. 빛을 증가시켜 현미경 섹션에서 투석실 내부에서 볼 수 있습니다. 실험 중에 셀의 밝기가 다를 수 있습니다. 매개 변수를 조정하여 투석 챔버 내부를 명확하게 시각화합니다. 또한 더 나은 보기를 위해 “줌”앞의 버튼인 +와 버튼을 사용하여 배율을 증가하거나 감소시킬 수 있습니다. 현미경 섹션의 오른쪽에는 각 결정화 실험에 대한 관련 정보를 저장하기 위한 여러 섹션이 있습니다. 각 사용자는 사용되는 투석막의 결정화 조건, 단백질 이름 및 분자량 차단에 대한 정보를 저장하는 폴더를 만들 수있다(도 8(3).. 사용자는 Nom Dossier [폴더 이름]에입력하기만 하면 실험 이름을 정의할 수 있습니다. Dossier [폴더 버튼]을 클릭하면 그림 8의녹색 프레임으로 표시됨이 새 창을 엽니다. 이 창에는 실험에 정의된 모든 정보가 포함된 텍스트 파일이 있습니다. 또한 타임스탬프가 찍힌 이미지는 향후 처리를 위해 이 폴더에 저장됩니다. NB 이미지 섹션에서 실험 중에 수행해야 하는 이미지 수를 선택합니다. 오른쪽 패널의 이미지 수를 이러한 시간 간격과 함께 지정합니다(예: 최소, 시간, 일). 그림 8은 1분 안에 0개의 이미지를 기록하는 소프트웨어 설정을 보여 주어 있다.참고: 폼페 [펌프] 섹션을 사용하여 스톡 솔루션을 혼합하고 결정화 솔루션을 저수지 챔버에 주입하십시오. 유체 혼합 시스템의 원리에 대한 설명은 섹션 2.1.10 및 도 7을 참조하십시오. Etape 1 [1단계]에서 주식 솔루션의 입력 농도: 솔루션 주식. 다음 섹션에서 결정화 실험을 위해 NaCl 4 M 및 CH3COONa 1 M pH 4가 사용됩니다.참고: 재고 솔루션의 농도는 어금니 단위로 되어 있습니다. 각 솔루션의 최종 농도를 정의합니다. 예를 들어 NaCl용 0.75M, CH3COONa pH 4의 경우 0.1 M. 최종 농도 섹션(도8)에 입력하여 2단계 [2단계]: 솔루션 à préparer [준비용액]. 그림 8에빨간색 프레임으로 표시된 계산 [계산] 버튼을 누릅니다. 혼합에 사용되는 각 스톡 솔루션의 최종 볼륨은 각 농도 패널 앞의 볼륨 패널에 표시됩니다. 랜서 프레파리션【발사 준비】 버튼(그림8)을누릅니다. 도 7에도시된 바와 같이, 로터리 밸브는 각 스톡 용액을 가져와 스위치를 통해 믹싱 튜브에 주입합니다. 결정화 용액이 준비된 후, Etape 3 [단계 3]의 Entrée 솔루션 [솔루션 입력] 버튼을 클릭합니다: 펌프 섹션의 플럭스(그림 8의노란색 프레임). 스위치는 튜브를 혼합하여 저수지 챔버로 전환하여 새로운 결정화 용액을 주입합니다. 교환 프로세스를 중지하려면 Arrêt 배포 [배포 중지] 버튼을 누릅니다.참고: 실험 중에 결정화 공정을 관찰하고 감독 소프트웨어의 해당 그래픽 인터페이스에서 온도, 결정화 솔루션 및 줌과 같은 매개 변수를 수정합니다. 소프트웨어를 사용하면 실험 중에 밀폐 캡이나 유동 셀을 제거할 필요가 없으므로 유일한 변수는 사용자가 소프트웨어를 통해 변경하는 변수가 됩니다. 큰 결정 성장 투석챔버(도6A)에30 mg·mL-1 농도로 리소지메 15μL을 첨가한다.참고: 섹션 1.1에 설명된 바와 같이 단백질 샘플을 준비합니다. 섹션 2.1 및 도 6에설명된 바와 같이 온도 조절 된 흐르는 저수지 투석 설정을 조립한다. 결정화 용액을 준비합니다. 0.22 μm 필터로 샘플 준비 전에 모든 스톡 솔루션을 필터링하는 것을 잊지 마십시오. 이 실험의 경우 결정화 용액에는 0.75 M NaCl 및 0.1 M CH3COONa pH 4가 포함되어 있습니다. 이는 2.2.10 ~ 2.2.12 섹션에 설명된 바와 같이 수동으로 또는 저수지 챔버 및 펌핑 시스템을 사용하여 첨가할 수 있다. 2.2.3 및 2.2.4 섹션에서 설명한 대로 온도를 295 K로 설정하고 이미지 8에 도시되어 있습니다. 초기 조건하에서, 투석실과 저수지 사이의 평형은 약 90분 후에 도달되고 첫 번째 눈에 보이는 핵은 22시간 후에 나타날 것이다. 결정의 크기에 더 이상 눈에 보이는 변화가 관찰될 때까지 결정이 자라도록 허용한다(도9,패널 1).참고: 핵형성 시간을 결정하고 결정의 크기 변화를 측정하기 위해, NB 이미지 섹션에서 시간당 각각 4 또는 3 개의 이미지인 15 또는 20 분마다 이미지를 기록합니다. 단백질 성축의 시상 관찰을 위해, 응집 및 침전 또는 결정 용해 또는 핵형성, 전형적으로 몇 초에서 몇 분 사이에 필요합니다. 그러나, 결정 성장에 대 한, 이 범위는 몇 분 에서 몇 시간 사이. 3일 후, 온도를 291K로 낮추어 크리스탈 성장을 다시 시작합니다. 온도를 일정하게 유지하고 결정이 개발하게하십시오(그림 9,패널 2). 실험의 이 단계에 대해, 2시간마다 이미지를 기록하고 10~12시간마다 결정의 크기 변화에 대해 확인하는 것으로 충분할 것이다. 결정의 크기변화가 관찰되지 않으면 실험을 계속할 수 있다.참고: 결정화 용액및 사용되는 단백질의 양에서 단백질 과 침전 농도에 따라 각 단계에 대한 평형에 도달하는 데 필요한 시간이 다를 수 있습니다. 온도를 288K로 줄이면 크리스탈 성장을 다시 시작하십시오. 여기에 제시된 사례의 실험 조건에서, 어느 날은 평형에 도달하기에충분하다(도 9,패널 3). 결정의 크기를 확인하고 결정이 계속 증가하는 한 일정한 온도를 유지합니다. 4일 후, 결정 성장을 다시 시작하기 위해 온도를 275K로 감소시다(그림9,패널 4).– 제시된 케이스의 실험 조건에서, 약 10일 후에 1차원으로 500 μm인 결정이 얻어질것이다(도 9). 크리스탈 크기 제어 2.3.1 및 2.3.2 항에 설명된 바와 같이 설정된 단백질 용액 및 온도 조절 유동 저수지 투석을 준비한다. 0.9 M NaCl 및 0.1 M CH3COONa pH 4로 결정화 솔루션을 준비합니다. 온도를 291 K로 설정하고 결정이 자랄 수 있도록 합니다. 초기 조건하에서, 첫 번째 핵형성 이벤트는 약 1시간 후에 시작되며, 수많은 결정이 3시간 동안 투석실에서 자랍니다(그림10,단계: 1 및 2). 성장 과정에서 결정의 크기를 확인하기 위해 20 분마다 이미지를 기록합니다.참고: 결정화 조건의 최적화는 생성된 결정의 대부분의 최종 특성을 제어하는 데 매우 중요합니다. 결정화 용액의 온도 및 화학 조성물은 균일한 크기의 결정을 용해하고 재성장하도록 변경할 수 있습니다. 또한 단백질 샘플이 이러한 실험에서 소비되지 않는다는 점에 유의해야 하며, 이는 변성되지 않는 한 시료를 재용해 두기 위한 조건이 역전될 수 있기 때문에. 온도를 변경하고 일정한 화학 적 조성을 유지하여 결정을 용해할 때 다음과 같이 실험을 계속하십시오. 결정이 291 K에서 성장하면, 이들은 더 적은, 더 큰 결정을 다시 성장하기 위해 용해 될 수있다. 313K에 도달하기 위해 20 분 이상 점차적으로 온도를 증가시다. 투석실 내부의 모든 결정을 용해하는 데 약1시간이 걸립니다(그림 10,단계: 3-5). 5~15분마다 이미지를 기록하여 용해 프로세스를 모니터링합니다.참고: 많은 단백질은 고온에 민감합니다. 단백질이 안정된 온도 범위 내에서 작동하여 손상/저하를 피하십시오. 단백질 용해도 외에도 온도는 완충액에 영향을 미칩니다. 예를 들어 버퍼의 pH는 특히 Tris 버퍼에서 온도와 함께 변경될 수 있습니다. 이러한 경우, 실험이 수행되는 온도에 따라 pH를 설정하는 것이 중요하다18. 또한 단백질 용해는 단백질 결정 성장에 비해 훨씬 적은 시간(몇 분에서 몇 시간)이 소요된다는 점에 유의해야합니다 (몇 시간에서 며칠까지). 일반적으로, 결정의 용해 시, 온도가 서서히 천천히 증가(짧은 총 용해 시간을 존중함), 주로 결정모사이드의 증가를 피하기 위해 결정의 부분용해의 경우. 결정이 커지면 온도가 설정된 온도(긴 총 성장 시간을 존중)로 빠르게(1분 미만)까지 감소할 수 있습니다. 이미지를 기록하여 결정화 챔버의 정기적인 모니터링은 단백질의 손상을 방지하고 연구된 각 단백질에 대한 결정의 용해 또는 성장을 위한 최적의 시간을 정의하는 데 도움이 되는 것이 좋습니다. 모든 결정이 용해된 후 온도를 295 K로 설정하여 제2 핵형성 이벤트를 개시하였다(도10,단계: 6,7). 두 번째 핵 형성 과정을 모니터링하기 위해 5분마다 이미지를 기록합니다. 이 단계에서, 첫번째 핵은 약 18 분 후에 나타납니다.참고: 이 온도에서 용액은 메타스터블 구역 부근의 핵형성 영역에 있을 것이다. 그 결과, 결정화 챔버에 몇 가지 핵만 나타납니다. 더 큰 결정을 성장하기 위해 섹션 2.3에 설명된 최적화 워크플로우를 반복하는 실험을 계속합니다. 도 10에 표시되는 실험의 총 지속 시간은 며칠밖에 되지 않습니다.참고: 핵화 단계에서 결정이 서로 다른 시간에 나타나면 결정화 챔버에서 상이한 크기의 결정이 얻어진다. 이러한 경우 온도의 증가(직접 용해도가 있는 단백질의 경우)는 더 작은 결정의 더 빨리 용해될 것입니다. 운동 성숙 효과에 따라, 여분의 단백질 (용해에서 얻은)은 더 큰 결정의 성장에 사용될 수 있습니다.결정화 용액의 화학 적 조성물을 변경하여 일정한 온도에서 결정을 용해할 때 다음과 같이 실험을 계속하십시오.또한 실험 중 결정화 용액의 화학적 조성물을 변경하여 이전에 재배한 결정을 용해하여 새로운 조건하에서 균일하게 크기의 결정의 인구를 재성장시킬 수도 있다. 전술한 바와 같이 단백질 용액(2.3.1), 온도 조절 유동 저수지 투석 설정(2.1) 및 결정화 용액(2.4.2)을 준비한다. 메타스터블 존에서 멀리 떨어진 핵형성 영역의 초기 조건하에서, 수많은 작은 결정이 결정화 챔버에 나타나고 성장하기시작합니다(도 11,단계: 1,2). 3시간 후, 결정화챔버(도 11,step: 3)에서 많은 중형 결정이 보이면 NaCl 농도(0.9M)를 점진적으로 감소하여 0에 도달한다. 이를 위해 0.1 M CH3COONa pH 4로 버퍼 용액만 을 포함하는 새로운 결정화 솔루션을 준비하십시오. 펌핑 시스템을 사용하여 저수지 챔버의 결정화 용액과 교환합니다. 2.2.10 ~ 2.2.12 단계를 수행하여 저수지 챔버에 새로운 용액을 준비하고 주입하십시오. 이 새로운 솔루션을 사용하면, 용액이 교환될 때 저수지 챔버의 최종 용액이 CH3COONa pH 4의 0.1 M 이하를 포함하지 않고 NaCl이 없을 때까지 챔버내의 NaCl 농도가 감소합니다. 10분마다 이미지를 캡처하여 용해 프로세스를 기록합니다. 결정이 완전히 용해되도록 허용합니다(그림 11,단계 : 4,5). 용해 시간은 이 실험의 경우 약 2시간입니다. 앞서 언급했듯이, 용해 시간은 단백질 시스템, 결정화 조건 및 투석 챔버 부피에 의존한다. 결정화 챔버의 정기적 인 관찰 (현미경 섹션 참조) 및 실험 중에 이미지와 노트를 기록하는 것은 필수적입니다. 챔버 내부의 모든 결정이 용해되면(도11,step: 5), 펌핑 시스템을 다시 사용하여 이전 보다 낮은 농도로 NaCl을 주입하여 새로운 결정화 용액을 준비한다(0.75 M NaCl in 0.1 M CH3COONa pH 4). 새로운 용액을 저수지 챔버에주입(도 11,단계: 6,7) 섹션 2.3에 설명된 바와 같이 결정화 성장 최적화 워크플로우를 반복한다. 더 큰 결정의 균일 한 인구가 생성됩니다. 도 11에 표시된 결과는 며칠 후에 얻어졌다.