通过微透析对芯片上的蛋白质进行结晶，用于 原位 X射线衍射研究

1. 面具设计和主制造 使用任何矢量绘图软件绘制微流体设备所需的几何形状。对于用于下一步光刻的光刻器的每一层，准备一个单独的面膜：一个带通道和柱子的面罩，一个只包含柱子的面罩。 将绘图软件生成的 CIF 文件转换为胶片光照。这可以通过商业服务来完成。需要适当的光刻，具体取决于光刻中使用的光刻机的选择。注：对于SU-8光防，请在透明背景上订购带有黑色特征的口罩。SU-8 是基于环氧树脂的负光电逆体，这意味着在紫外线照射（365 nm）时，暴露在紫外线下的部分是交叉链接的，而其余部分仍可溶性。因此，在光刻过程中，面罩上的所有黑色图案不会被紫外线交叉连接。通道和柱子将刻在主人身上。 使用SU-8负光刻技术，通过光刻技术为每个芯片的设计准备两个硅晶片大师。注：步骤 1.3.1-1.3.7 在干净的房间里执行。下面描述的步骤是光刻的传统步骤，然后是 PDMS 软光刻，这在许多教科书中都进行了描述。实验参数的所有值（光电图、时间持续时间、温度等）都依赖于许多细微的参数，并且必须根据所使用的不同仪器进行优化。 使用 3 英寸硅晶片，用等离子体处理表面 90 s，以方便 SU-8 光抗光片的沉积和附着。 将大约 3 mL 的 SU-8 电阻倒在晶圆中间，将 SU-8 旋转涂层降至所需的厚度（图 1A）。对于 50μm 名义厚度，请使用 SU-8 3050，在 500 rpm 时使用 10 s 旋转涂层，在 3500 rpm 时连续使用 30 s。在368K的热板上软烤15分钟，让树脂中所含的溶剂蒸发并防止它粘在光面具上，从而部分凝固。之后，在室温下将晶圆留出2分钟。 将光电图暴露在紫外线下（图1B）。使用具有 35 mW cm-2 和 8 s 曝光时间功率的面膜对齐器。 继续暴露后烘焙。将晶圆以 368 K 将晶圆放在热板上 5 分钟，以完成紫外线照射所调用的光反应。 将晶圆放入含有丙二醇甲基乙醚醋酸酯 （PGMEA） 的浴缸中，取出所有未交叉链接的 SU-8 电阻，搅拌 15 分钟。用异丙醇冲洗晶圆，直到观察到没有模糊的降水。用氮气干燥晶圆，并储存在培养皿中（100 毫米 x 15 mm 标准尺寸）。 用硅烷处理晶圆表面，以方便分离用于制造2枚邮票的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。将晶圆沉积在 368 K 的轻拍热板上 10 分钟，在六甲基迪西拉赞 （HMDS） 的蒸汽大气下。注意：如果多次使用后难以从晶圆上剥离 PDMS，则晶圆表面应再次使用 HMDS 蒸汽处理。 包含通道和柱子的第一个主已准备就绪。重复这些步骤，并准备第二个主图案只有支柱。注：在光刻过程中，目标是在身高为 50μm 的 SU-8 大师身上获取设备的几何形状。然而，一旦两个SU-8大师被制造，测量刻在大师上的几何高度与熟练的仪表，以获得实验价值。为此协议制造的两个 SU-8 主值的测量值约为 45μm。 2. PDMS 模具制造 注：只要使用层压流罩，在使用 NOA 81 树脂（步骤 3.6-3.11）时使用室内的黄光，并且可用于聚合 NOA 81 树脂（步骤 3.7 和 3.11），即可在任何实验室执行协议的以下步骤。 以 10：1 的质量比准备 50 克 PDMS 硅胶碱及其固化剂。 将烧杯中的两种成分与铲子混合，并将混合物放入真空室中，以去除所有气泡。 将 25 克预混合 PDMS 倒入 SU-8 主菜（储存在培养皿中），将通道和柱子的高度高达约 5 毫米。将 PDMS 的剩余 25 克倒入第二个 SU-8 主图案中，仅将柱子高度高达约 5 mm（图 1C）。 将培养皿放在烤箱中，以 338 K 的 PDMS 层治愈 1 小时。 用手术刀切割 SU-8 大师图案周围的固化 PDMS 层，并轻轻地从大师身上剥下 PDMS 模具（图 1D）。注：上述程序称为复制成型，经常用于制备 PDMS 的模具，这些模具将连接到玻璃表面，并成为微流体设备53的一部分。在此协议中，PDMS 模具不是芯片的一部分，而是用作芯片制造的中间体。对于每个设计，2个PDMS模具由各自的SU-8大师（图1D和1E）制备，并将相应地（如下所述）用于微芯片的制造。 3. 透析芯片制造 将 PDMS 模具图案的通道和柱子放在刚性显微镜玻璃滑梯上（标准尺寸为 3 x 1），图案朝上（图 1F）。对应蛋白质储层的中央柱子从 PDMS 模具的水平表面垂直超过 45μm。 切割并分离再生纤维素 （RC） 透析膜的干片，并将其存放在 PDMS 模具的中央柱子上，该柱子支持在玻璃滑梯上（图 1F）。注：RC透析膜是商业上可用的，分子量截止（MWCO）是根据所研究的蛋白质的分子量和所使用的沉淀物相应地选择的。RC透析膜的尺寸取决于芯片的设计。在此协议中，设计了 2 个原型，其中蛋白质储层的体积为 0.1 或 0.3 μL。在这些情况下，透析膜片的大小分别为2×2毫米2或4×4毫米2。 将第二个 PDMS 模具仅朝下的柱子放置在玻璃滑梯上支持的 PDMS 模具顶部（图 1F）上。该模具的中心柱子对应蛋白质储层，从水平表面垂直（朝下）超过 45μm。 对齐 2 PDMS 模具的中心支柱。RC透析膜在2个PDMS模具（图1G）之间被”夹合”。注：2 PDMS 模具的微观结构之间的对齐可以在视觉上完成，无需任何额外设备。否则，这种操作可以在显微镜下完成。只要不完全覆盖流畅通道和输入或输出点，水库之间的小班次是没有问题的。 在真空室中干燥组件 30 分钟，以清除 PDMS 模具中所有被困的气泡，并在制造的下一步促进树脂的插入。注：2 PDMS 模具由 PDMS-PDMS 粘附保持到位，无需额外压力或其他临时粘合方式。 通过毛细环（图1H 和1I）填充2个PDMS模具之间的空白空间，采用光可光可治愈的、基于硫林的树脂NOA 81。 使用校准紫外灯（功率为 35 mWcm-2）将树脂暴露在紫外线下（365 nm）为 8 s 进行治疗。注：此首次暴露允许 NOA 81 树脂部分交叉链接，因为与两侧 PDMS 模具接触的 NOA 81 薄层仍未被治愈。 用手术刀从 PDMS 模具的外部切除 NOA 81 的过量。 从底部 PDMS 模具和玻璃滑梯上取下部分交叉链接的 NOA 81 上部 PDMS 模具。 在显微镜玻璃滑梯（3 x 1 英寸）的标准尺寸中切割 175μm 厚的 PMMA 薄片，并从 PMMA 片的每一侧剥下塑料保护板。轻轻按 PMMA 件上的上 PDMS 模具和部分固化的 NOA 81 的组件（图 1J）。 再次治疗 NOA 81 通过暴露在紫外线下 60 s 和删除上 PDMS 模具 （图 1K）。树脂粘附在PMMA基材上，无需进一步治疗。注：PDMS 模具在用异丙醇和丙酮清洗后可重复使用约 5 次，只要模具不弯曲。RC透析膜被纳入NOA 81贴纸，无需进一步操作或机械夹紧。 4. 流体连接器 注：微流体芯片的设计包括结晶溶液的线性流体通道和蛋白质样本（蛋白质储层）的中央储层，均从 图2A中两个微芯片的顶部视图显示。RC透析膜嵌入在这两个微结构（图2D）之间，结晶过程演变，而结晶溶液的沉淀物由于由膜分离的芯片两个隔间之间的浓度梯度而扩散到膜上。微流体通道印在底部 PDMS 模具上（图1F）。芯片的制造协议完成后，线性通道位于 NOA 81 贴纸的底层，与 PMMA 基板接触，如 图 1K所示。结晶解决方案的入口和插座接入点位于线性通道的每一端，看起来像 图 2A中可见的孔（总高度 90μm）。要处理结晶解决方案，必须在接入点上添加连接器。 带快速环氧胶（图2C）的微流体通道入口和出口上市售的债券连接器（NanoPort）。 根据连接器的大小选择适当直径的 PTFE 管。PTFE管将用于在芯片的流体通道中引入结晶溶液。注：建议商业上可用的套件轻松精确地控制流速，通常与自动压力驱动或流量控制（注射器泵）系统相结合，用于混合和流体处理。但是，结晶溶液可使用一次性塑料注射器手动引入线性通道。在这种情况下，建议步骤 4.3 到 4.5。 将 1 mL 一次性注射器与结晶溶液填充。对于此协议中提出的芯片，400 μL 就足以填满整个流体通道。 切割两个移液器尖端，使一侧尖端的直径等于用于溶液处理的 PTFE 管的内径。用快速环氧胶（图2B）将裁剪的提示粘在通道的接入点上。 将注射器与裁剪的提示连接起来，使用适当尺寸的 PTFE 管，并通过不断缓慢地按压注射器柱塞来引入通道内的解决方案。 5. 蛋白质封装 注：专用于用作蛋白质储层的芯片的图案迄今仍对大气开放。建议下列方案小心地将蛋白质样本限制在微流体芯片内。 手动移液器蛋白质储液库内的蛋白质样本液滴，位于RC透析膜上， 如图2E所示。蛋白质样本的体积因芯片设计而异，可为 0.1 或 0.3 μL。 在蛋白质储层周围涂抹一层薄薄的高真空硅胶油脂。 切一小块 175μm 厚的 PMMA 薄片，轻轻放在硅胶油脂的薄层上方。PMMA 片必须覆盖蛋白质溶液沉积的蛋白质储层的整个表面。注：硅胶油脂用于增强气密性，防止蛋白质液滴扩散。用于覆盖蛋白质储层的 PMMA 片与 NOA 81 贴纸之间没有粘合或密封。它们之间的接触是一个固体/固体接口。为了产生蛋白质样本的整体密封和气密封装，使用第 5.4 步中描述的一块 Kapton 胶带。注：当压力驱动系统用于在流体通道内引入结晶溶液时（步骤 6.4），有时很难将蛋白质样本限制在设备（蛋白质储层）的专用腔内。为了避免上述问题，在循环结晶解决方案时应保持相对较低的压力值。水溶液的喷射压力为20-60mbar，水溶液的注塑压力为50-150mbar，建议注射更多粘性溶液（PEGs，甘油）19。 切一块卡普顿胶带（20μm 厚），足够大，足以覆盖蛋白质储层上方的 PMMA 片，并粘在 NOA 芯片上。蛋白质样本被封装在储层内，芯片准备用于结晶实验，如 图2C所示。注：只要透析膜和 NOA 在 PMMA 基板上的粘附不变质，芯片就可以重复使用数倍。如果芯片的这些部分损坏，则会观察到泄漏，以验证设备是否不能再使用。清洗芯片取决于结晶溶液。在低粘度溶液（盐、缓冲液）的情况畅通道只需引入蒸馏水即可洗净，并让它流动几分钟。400 μL 是将通道内的解决方案与另一种解决方案完全交换所需的音量。在更粘稠的溶液（PEGs，甘油）的情况下，不建议重复使用芯片，因为只用水清洗通道是不够的。蛋白质储层所在的芯片上部也可以用蒸馏水清洗，用加压空气干燥。 6. 片上蛋白质结晶 称重亲血亲母鸡蛋清溶酶粉，溶解在蒸馏水中，最终浓度为30毫克mL-1。 通过 0.22 μm 过滤器和离心机过滤蛋白质溶液 5 分钟，最高速度为 293 K，以去除所有固体颗粒。使用超纳坦进行结晶实验。 准备 500 μL 的结晶溶液，其中含有 表 1中提供的浓度缓冲液和沉淀剂。通过 0.22 μm 过滤器过滤解决方案。 将溶液注入芯片的入口点，使用注射器或自动压力驱动的流体系统或注射器泵，如步骤 4.1-4.5 所述。注：如果微流体通道充满结晶溶液并放在一边，或在流动条件下，如果以恒定的流速在通道内连续注入，则结晶实验可以在静态条件下进行。对于后一种情况，建议使用外部压力驱动系统或注射器泵。在流动条件下实现实验也为在流体通道内动态交换结晶溶液提供了可能性。因此，在使用同一蛋白质样本时可以进行多种实验。 流体通道充满结晶溶液后，用准胶带密封芯片的入口和出口端口。 将蛋白质溶液的适当体积分移到蛋白质储液中，并封装第 5.1-5.4 步中描述的蛋白质样本。 将芯片存储在293K。注：根据测量数据51，透析的结晶遵循与用蒸汽扩散方法或批量结晶进行的实验不同的动能轨迹，并深刻地取决于参与扩散过程的沉淀分子的性质，核开始可能需要更多时间。为了防止蒸发，如果有的话，在此期间，将芯片放置在湿度饱和大气中293K。 7. 原位 和片上X射线衍射 光束线的 3D 打印支持 打印支持，可同时携带多达三个芯片。支撑的尺寸与商用结晶板（96 井/SBS 标准）的尺寸相同，与板 X 射线衍射实验相容。注：支持打印可分配给商业服务。该支持采用 3D-CAD 设计软件设计，在芯片蛋白结晶实验期间显示图3A，在 BM30A-FIP （ESRF） 现场 X 射线衍射数据收集中显示图 3B。 用单面或双面胶带稳定支架上的透析芯片。 就地 X射线衍射 从蛋白质储层中生长的晶体收集室温下的X射线衍射数据。例如，使用能量为 12.656 keV 的 X 射线、3.32 x 1010 光子s-1 和 250 x 250 μm2的光束大小。使用 ADSC 量子 315r 探测器记录衍射图像，矩阵为 3 x 3 CCD，活动表面分辨率为 315 x 315 mm2 和 940 万像素。注：透析芯片上生长的溶酶晶体的衍射数据是在欧洲同步辐射设施（ESRF）的BM30A-FIP光束线采集的。但是，在其他 X 射线辐射源中，光束大小、通量和探测器类型可能有所不同。3D 打印支持使数据收集在晶体周围具有 -40° 到 +40° 的角范围。 现场 数据收集所暴露的酶晶体数量、每个晶体收集的衍射模式数量、每次暴露的振荡角度范围和暴露时间在 表2中进行汇总。 数据处理 使用 XDS 程序48处理淋酶晶体的衍射模式的完整或部分数据集。 为每个数据集生成 HKL 文件，并使用 XSCALE 软件48进行缩放。 使用分子替换与 CPP4 套件49 的程序分阶段器，并确定模型构建的阶段。对于此步骤，请使用蛋白质数据库 （PDB） 条目 193L 中已知的酶 3D 坐标。 使用Phenix52 优化结构，使用COOT50检查最终蛋白质模型。