JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

Automatiseret produktion af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kortikale og dopaminerge neuroner med integreret Live-Cell Overvågning

Published: August 06, 2020
doi:
10.3791/61525
, , , , , , , , , ,
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research,University of Tübingen

Summary

Vi viser automatisering af human induceret pluripotent stamcelle (hiPSC) kulturer og neuronal differentiering kompatibel med automatiseret billeddannelse og analyse.

Abstract

Manuel kultur og differentieringsprotokoller for humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er vanskelige at standardisere, viser høj variation og er tilbøjelige til spontan differentiering i uønskede celletyper. Metoderne er arbejdskrævende og er ikke let modtagelige for store eksperimenter. For at overvinde disse begrænsninger udviklede vi et automatiseret cellekultursystem koblet til et billedsystem med høj overførselshastighed og implementerede protokoller til vedligeholdelse af flere hiPSC-linjer parallel og neuronal differentiering. Vi beskriver automatiseringen af en kortsigtet differentieringsprotokol ved hjælp af Neurogenin-2 (NGN2) overudfoldelse til at producere hiPSC-afledte kortikale neuroner inden for 6\u20128 dage og implementering af en langsigtet differentieringsprotokol for at generere hiPSC-afledte midbrain dopaminergiske (mDA) neuroner inden for 65 dage. Også, vi anvendt NGN2 tilgang til et lille molekyle-afledte neurale forløber celler (smNPC) transduced med GFP lentivirus og etableret en levende celle automatiseret neurite udvækst assay. Vi præsenterer et automatiseret system med protokoller egnet til rutinemæssig hiPSC kultur og differentiering i kortikale og dopaminerge neuroner. Vores platform er velegnet til langsigtet håndfri kultur og højindhold/høj-throughput hiPSC-baserede sammensatte, RNAi og CRISPR/ Cas9 screeninger for at identificere nye sygdomsmekanismer og narkotikamål.

Introduction

Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er selvforsynende og kan differentiere i næsten enhver voksen celletype. Disse egenskaber gør hiPSC et nyttigt redskab til sygdomsmodellering i grundforskning og lægemiddelopdagelse1. Human iPSC bevarer donorgenetiske baggrund, som gør det muligt at udlede sygdomsrelevante celletyper, der er mest berørt / involveret i sygdomsforløbet, for eksempel forskellige neuronale undertyper for neurodegenerative sygdomme2,3. Også hiPSC overvinder nogle af de begrænsninger af dyr og cellulære over-udtryk modeller ved modellering sygdomme i en menneskelig sammenhæng og fysiologiske protein udtryk niveauer, og har vist sig at være et værdifuldt aktiv i modellering sygdomme lige fra monogene, komplekse og epigenetiske lidelser samt sent indsættende sygdomme4.

På trods af disse fordele og muligheder er der stadig flere begrænsninger i hiPSC, der skal løses. Nuværende hiPSC kultur og differentiering protokoller er ikke omkostningseffektive, vanskelige at standardisere og er arbejdskrævende. Manuelle kulturtrin kan resultere i høj variation i udbyttet og fænotyperne på grund af forskelle i vækst og spontan differentiering af hiPSC. Derfor skal eksperimentatorafhængig variation reduceres ved at implementere mere standardiserede håndteringsteknikker og forenkle protokoller, der kan opnås ved hjælp af automatisering5. Indførelsen af automatiserede hiPSC-kultur- og differentieringsprotokoller vil fastsætte fælles standarder for både akademiske og industrielle forskningsprojekter og muliggøre generering af biologisk relevante sygdomsmodeller og mere reproducerbare resultater.

Tidligere arbejde har forsøgt automatisering af hiPSC kulturer6,7,8, men deres protokoller har været begrænset til specifikke cellekultur plade formater afhængige af systemet og mangler tilpasningsevne til forskellige analyse formater. Sådanne systemer er nyttige i bulking af celler, men kan ikke være egnet til automatiseret differentiering i ønskede celletyper, sygdom fænotypebestemmelse, og screening formål. Derudover er en storstilet automatiseret platform for fibroblast afledning, hiPSC generation og differentiering blevet beskrevet9, men på en skala, der kun kan opnås ved high-throughput laboratorier dedikeret til produktion af linjer, der synes attraktive, men kan være uoverkommelige for mange akademiske laboratorier.

Vi udviklede et fuldautomatisk cellekultursystem baseret på en væskehåndteringsstation i et hepa-filtreret miljø (High-Efficiency Particulate Air) sammen med en CO2-inkubator med stor kapacitet, et lysfeltsbilledcytometer og en robotarm til pladetransport. Disse komponenter danner grundlag for stabil og reproducerbar hiPSC kultur og differentiering. Vi supplerede systemet med et automatiseret -20 °C lagersystem til blanding eller virus opbevaring og en high-speed spinning disk konfokale live-celle imager. Skræddersyede protokoller blev genereret tillader automatiseret celle såning, medieændringer, sammenløb kontrol, celle ekspansion og analyse plade generation med prøve behandling og plade billeddannelse, hvilket gør systemet kompatibelt med højt indhold / høj-throughput screeninger. Det automatiserede cellekultur- og billedsystem drives ved hjælp af den styrende software og den skræddersyede grafiske brugergrænseflade (GUI). GUI’en giver brugerne mulighed for at importere CSV-filer, der indeholder cellelinjespecifikke parametre, der er nødvendige for metodekørsel. Derudover gør GUI’en det muligt at planlægge mange eksperimenter i enhver sekvens ved hjælp af den indbyggede kalendervisning, hvilket giver fuld kontrol over det tidspunkt, hvor hver metode starter.

Vores automatiserede cellekultursystem bruger standardiserede pipetteringshastigheder, afleveringstider, sammenløbstærskler, såningstætheder og mellemstore volumener med fleksibilitet til at dyrke celler i en række forskellige pladeformater (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brøndpladeformat). Vi har tilpasset en nyligt offentliggjort kortsigtet differentiering protokol til konvertering af hiPSC til neuroner, der kan give TUBB3 positive neuroner i 6 dage10,11. Vi har også etableret den automatiserede differentiering og billeddannelse af små molekyle neurale prækursorceller (smNPC) i neuroner konstituerende udtryk for GFP under EF1a promotor12 og iPSC i midbrain dopaminerge (mDA) neuroner, tilpasse en tidligere offentliggjort dual-SMAD hæmning protokol13, der giver mDA neuroner inden for 65 dage.

Protocol

1. Grundlæggende procedurer for automatisering af cellekulturer og billeddannelse Læg nye kulturplader og spidser Åbn GUI’en, og klik på knappen Ressource-/instrumentprocesvisning. Hvis du vil køre en ressource-/instrumentproces, skal du vælge ressource-/instrumentprocessen og klikke på procesknappen Kør instrument. Kør ressourceprocessen RunHepaHood and Reloading (se trin 1.1.1). Åbn døren, læg cellekulturpladerne og engangsspidserne i den tilsvarende position som angivet i pop op-billedet på den styrende pc. Tør døren af med 70% ethanol til dekontaminering og luk den. Kør instrumentprocessen Dekontaminering fra GUI ‘en (se trin 1.1.1). Systemet bliver steriliseret af UV-stråling i 30 min. Refill kultur medier og / eller dissociation reagens Udfør instrumenttrinnet RunHepahood (se trin 1.1.1). Åbn hoveddøren til væskehåndteringsstationen. Dekontaminerede reservoirer (indeholdende medier, PBS og/eller dissociation reagens) med 70% ethanol og læg dem på dækket til den tildelte positon (som defineret i cfg.csv fil). Afgræns beholderne. Dekontaminere døren med 70% ethanol og luk den. Tænd hepa-hætten ved at køre ressource-/instrumentprocessen “InitHepaHood” fra GUI’en. Oprette en ny “cellelinje” og et nyt projekt i GUI’en Opret/rediger de brugerdefinerede “Cellelinje”-filer, der består af Config-filerne (*.cfg.csv), importen (*.imp.csv), ressourcen (*.rsv.csv) og arbejdsprocesfilerne (*.wfl.csv). Åbn GUI’en, og opret en ny “cellelinje” ved at klikke på knappen Tilføj cellelinje i visningen “Cellelinjeeditor”. En guide åbnes, hvor Config-filen skal vælges, og der skal angives et projektnavn med en kort beskrivelse. Naviger gennem denne guide ved hjælp af den grønne pilespids, og bekræft indstillingerne ved at klikke på det grønne flueben. Opret et nyt projekt for den genererede “cellelinje” ved at klikke på knappen Tilføj projekt. Angiv et projektnavn og en projektbeskrivelse, og definer en projektfarve, der skal være synlig i kalendervisningen for GUI’en. Gå til næste side i guiden ved at klikke på pilespidsen. Opret et nyt batch ved at klikke på knappen Tilføj batch og give et kort navn og en kort beskrivelse i pop op-vinduet. Vælg alle procestrin, og planlæg starttidstidsen for hvert procestrin. Luk vinduet ved at klikke på OK. Udføre en automatiseret metode ved hjælp af GUI Gå til kalendervisningen af GUI’en, og klik på knappen Tilføj procestrin. Markér cellelinjen, og når du har navigeret til næste side i guiden, skal du vælge projektet. Marker den batch, der skal bruges, og klik på pilespidsen, der peger mod højre. Afhængigt af den anvendte metode skal batcherne enten være tomme (til modtagelse af nye plader) eller indeholde kulturplader eller analyseplader (alle andre processer). Gå til næste side i guiden, og vælg det procestrin, der skal udføres. Gå til den sidste side i denne guide, og planlæg eksperimentet. I afsnittet “Parameterdetaljer” kan variabler, der er nødvendige for at køre metoden, ændres. Bekræft ved at klikke på OK. Belastning af kultur- og analyseplader i CO2-inkubatorenBEMÆRK: 1-brøndsplader defineres som kulturplader, da de almindeligvis anvendes til bulkceller. Alle multi-brønd plader er defineret som analyseplader. Udfør instrumentprocessen “RunHepaHood” fra GUI’en som beskrevet i trin 1.1.1. og åbne døren foran robotarmen. Tør bunden af analysepladerne af med 70 % ethanol og fnugfrit væv, hvis pladerne er indlæst til automatiseret billeddannelse. Placer kultur- eller analyseplader på venstre hylde. Sørg for, at pladens retning er korrekt. For analyseplader skal godt A1 pege mod robotarmen, mens kanterne af kulturpladerne skal pege til højre. Tør døren af med 70% ethanol til dekontaminering og luk den. Metoden “Loading Of Culture Plates” til import af 1-brøndplader eller “Loading Of Assay Plates” til import af multiblæstplader som beskrevet i trin 1.4. Brug en tom batch til at køre begge metoder. Hvis der allerede findes nummerpladekoder i dette batch, skal du fravælge dem ved at klikke på afkrydsningsfelterne. Transport af individuelle plader fra hylden til CO2-inkubatorplatformen ved hjælp af robotarmen. Den indbyggede plade shuttle station henter pladen og gemmer dem i en af stativerne i CO2 inkubator. Cellerne holdes ved 37 °C og 5% CO2. Losning af plader fra CO2-inkubatoren Metoden “Fjern plader” (se trin 1.4). Vælg den batch, der indeholder de plader, der skal eksporteres. Individuelle plader kan vælges af deres stregkoder. Transporter pladerne ud fra CO2-inkubatoren til venstre hylde med robotarmen. Start HEPA-emhætten ved hjælp af instrumentprocessen “RunHepaHood” som beskrevet i trin 1.1.1. og åbne døren foran robotarmen. Fjern pladerne, dekontaminere døren med 70% ethanol, før du lukker den og power down HEPA hætten. 2. Automatiseringsprotokoller Såning af plader fra rør Start HEPA-emhætten ved at udføre instrumentprocessen RunHepaHood (se trin 1.1.1). Åbn døren foran væskehåndteringsstationen. 50 ml rør, der indeholder celleaffjedring og afgål røret. Åbn døren foran robotarmen og belastningsbelagte kulturplader til modtagelse af celler på hylden. Dekontaminere og luk begge døre. Metoden “Såning af plader fra rør” udføres (se trin 1.4). Tæl celler ved brightfield-billedcytometeret ved hjælp af direkte celletællingsfunktion. Til celletælling skal du bruge 16 brønde som replikater i et 384-brønds pladeformat. Transporter den 384-brøndtællingsplade fra dækket til brightfield-billedcytometeret via drejeskælven ved hjælp af robotarmen, og start billeddannelsesprocessen. Cytometeret bestemmer automatisk celletallet pr. milliliter. Bring tællepladen tilbage til sin oprindelige position ved hjælp af robotarmen. Transporter en belagt kultur eller analyseplade fra hylden til pipetteringsdækket ved hjælp af robotarmen. Fjern belægnings- og frøceller i det brugerdefinerede tal og volumen, der passer til pladeformatet (se tabel 1). Flyt pladen til on-deck shaker i 10 s ved 500 rpm for cellefordeling og overføres til CO2-inkubatoren. Automatiseret sammenløbsvurdering Metoden “Kontroller sammenløbet” som beskrevet i trin 1.4. Vælg et parti, der indeholder mindst én kulturplade og ingen analyseplader. I afsnittet “Parameterdetaljer” input “iPSCf_2020” for billederhvervelse og billedbehandling analyseindstillinger. Transporter den første plade fra CO2-inkubatoren til det brightfield-billedcytometer via drejetallerkenen ved hjælp af robotarmen. Udfør billeddannelse af celler i brightfield imaging cytometer for sammenløbskontrol af hiPSC kolonier. Brug “sammenløb” ansøgning og billede 13 felter af 1-brønd pate og beregne automatisk det gennemsnitlige område besat af celler. Transporter pladen tilbage til CO2-inkubatoren ved hjælp af robotarmen. Gentag trin 2.2.2. til 2.2.4. for de resterende plader. Medieændring af kulturplader eller analyseplader Metoden “Media Change Of Culture Plates” udføres som beskrevet i trin 1.4. og vælg et parti, der kun indeholder kulturplader. Angiv variablen, der angiver, om spidser eller nåle bruges til pipetteringstrinnene i afsnittet “Parameterdetaljer”. For medieskift af enhver multi-brønd plade, udføre metoden “Media Change Of Assay Plader” og vælge et parti, der indeholder analyseplader. Transporter de enkelte plader fra CO2-inkubatoren til dækket ved hjælp af robotarmen og afdågene pladerne. Vip automatisk pladerne og indsugning af gamle medier, og kassér dem i affaldsindsamlingsmodulet. Tilsæt 12 ml frisk medie. Låget pladen igen, og transporter pladerne tilbage til CO2-inkubatoren ved hjælp af robotarmen. UnderdyrkningBEMÆRK: Udfør instrumentprocessen “RunHepaHood” fra GUI som beskrevet i 1.1.1. og åbne hoveddøren til væskehåndteringsstationen. Indlæsning af medier og dissociationsrose hos de ønskede positioner (se trin 1.2). Hvis det er nødvendigt at genopfylde spidserne, skal du bruge “Genindlæsning” som beskrevet i trin 1.1. Tilfør et 50 ml rør til modtagelse af celleaffjedring og afgål røret. Metoden “Subkultivation af klæbende celler” udføres (se trin 1.4). Vælg det parti, der indeholder kulturplader, der skal subdyrkes. Transporter pladerne fra CO2-inkubatoren til dækket ved hjælp af robotarmen og afdågene. Vip automatisk pladerne og fjern gamle medier, og kassér dem i affaldsindsamlingsmodulet. Vask celler én gang med 8 ml PBS. Der tilsættes 8 ml 0,5 mM EDTA til klumpbaseret passaging. Inkuber på dækket i 8 min. Fjern EDTA-opløsningen fra pladerne og kassér den i affaldsindsamlingsmodulet. Tilsæt 12 ml frisk medium og transport pladerne til shaker. Ryst ved 2000 rpm i 1 min for at løsne kolonierne. Triturate celle suspension for fem cyklusser af pipettering at bryde iPSC kolonier i en mindre størrelse (~ 50\u201280 μm). Celleophænget overføres til et 50 ml rør på dækket. Frøceller automatisk som beskrevet i trin 2.1.5 ved hjælp af et splitforhold på 1 i 7.BEMÆRK: Valgfri, enkelt celle passaging. Generér en enkelt cellesuspension ved hjælp af reagens af en enkelt celle (se Materialetabel). I stedet for 0,5 mM EDTA i trin 2.4.2 anvendes 8 ml opløsningsgenost med en enkelt celle og inkuberes i 20 minutter ved 37 °C. Opsaml cellesuspensionen i et 50 ml rør, og der tilsættes lige store mængder medier. Dissociation ved hjælp af encellede dissociation reagens kræver et manuelt skridt til at pellet cellerne. Centrifugeceller ved 300 x g i 3 min. Supernatanten fjernes, og cellepellet skal opbruges igen i 12 ml af det krævede medie, og fortsæt med “Såning af plader fra rør” (se trin 2.1). Supplere medierne med 2 μM thiazovivin på dagen for såning, når du bruger enkelt celle suspension af hiPSCs. Automatiseret billedbehandling med højt indhold og højt indholdBEMÆRK: Måleindstillingen skal være tilgængelig (se supplerende fil 1: trin 1.1). De analyseplader, der skal afbildes, fås i inkubatoren. Udfør metoden “Imaging” (se trin 1.4). Vælg et parti, der indeholder mindst én analyseplade og ingen kulturplade. I afsnittet “Parameterdetaljer” skal du indtaste pladetypen, pladedefinitionerne (for standard 96-brøndbilledplader: “Plate-96-20170918113842”) og navnet på måleindstillingen. Transporter analysepladen via drejetallerkenen til det automatiserede konfokale mikroskop ved hjælp af robotarmen for at starte billeddannelsesprocessen. Gendan pladen for enden af billeddannelsen fra mikroskopet, og transporter den tilbage til CO2-inkubatoren. Gentag processen med de resterende plader i batchen. 3. Automatiseret vedligeholdelse og udvidelse af hiPSC Rækkefølgen af automatiseret sammenløbskontrol, medieændringer og subdyrkning Frøceller på 1-brønds plader ved hjælp af “Såning af plader fra rør” metode (se trin 2.1). Alternativt kan du importere manuelt såede 1-brøndsplader ved hjælp af metoden “Loading of culture plate” (se trin 1.5). Planlæg automatiserede sammenløbskontroller dagligt for at overvåge kolonivæksten fra dag 1 til dag 6 af kulturen for iPSC (se trin 2.2). Opdater medier hver anden dag ved hjælp af metoden “Medieændring af kulturplader” (se trin 2.3). Der anvendes 12 ml medium pr. plade. På dag 6 skal du starte “Subdyrkningsprocessen” (se trin 2.4). 4. Automatiseret differentiering Human iPSC til kortikale NGN2 neuronerBEMÆRK: Manuel hiPSC forberedelse. Protokollen indebærer overudfoldelse af NGN2 ved hjælp af lentivirale vektorer til levering. Transduce hiPSC med NGN2 til rTTA3 lentivirus i et 1:2 forhold (> ~107 TU/ml). Celler vælges derefter for én passage med 0,5 μg/ml puromycin. En detaljeret protokol til generering af stabile hiPSC-NGN2-linjer findes i den supplerende fil 1: trin 2. Fortsæt med “Subkultivationsprocessen” som beskrevet ved hjælp af reagensen af en enkelt celle, der er beskrevet i note 2.4.4. når hiPSC nå 70\u201280% sammenløb Supernatanten fjernes og resuspender cellepellet i 12 ml NGN2-medier (Materialetabel), der indeholder 2,5 μg/ml doxycyclin (dox) og 2 μM thiazovivin. Differentiering ved hjælp af metoden “Såning af pladerfra rør” (se trin 2.1). Den ønskede såningstæthed for iPSC indstilles til 30.000/cm2 (se tabel 1). IPSC er belagt på forbelagte plader med 0,1 mg/ml poly-L-ornithin (PLO) og 5 μg/mL laminin.BEMÆRK: 1-brønds plader foretrækkes til RNA- og proteomicsbaserede undersøgelser, mens det 96-brøndpladeformat foretrækkes til billedforsøg. Andre analyseplade formater såsom 48-, 24-, 12- eller 6-brønd plader kan også anvendes. På dag 1 i differentiering, Refresh medier ved hjælp af “Media ændring af analyseplader (se trin 2.3) ved hjælp af NGN2 medium, suppleret med 2,5 μg/ml dox og 10 μM N-[2S-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-glycin, 1,1-dimethylethylester (DAPT). Fortsæt med medieændringer hver 2.20123-dag indtil den ønskede differentieringsdag (se trin 2.3). På dag 4 af differentiering, udføre en anden medieændring (se trin 2.3.) ved hjælp af NGN2 medium suppleret med 10 ng/ml hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF), 10 ng/ml gial celle-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) og 10 ng/mL neurotrofisk faktor 3 (NT-3) for at forbedre modning. Ved forsøgets afslutning eksporteres kulturpladerne fra systemet til downstream-forsøg (se trin 1.6). Små molekyle neurale prækursorceller (smNPC) til NGN2 neuronerBEMÆRK: Derive smNPC efter den tilpassede version af den offentliggjorte protokol12 (se supplerende fil 1: trin 5). Ændre smNPC med NGN2 og rTTA3 virus (se Supplerende Fil 1:trin 2). En runde NGN2 og rTTA transduktion er tilstrækkelig til at generere en stabil befolkning. Yderligere ændre smNPC med pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus gør det muligt at udføre live-celle overvågning. Der anvendes en mængde infektion (MOI) på 10 for GFP lentiviral transduktion. Passage smNPC ved opnåelse af sammenløb ved hjælp af en enkelt celle dissociation reagens som beskrevet i trin 2.4. Bemærk. Frøceller, der anvender det automatiserede cellekultursystem ved en celletæthed på 50.000/cm2 ved hjælp af “Såning af plader fra rør” (se trin 2.1.) på forbelagte plader med 0,1 mg/ml PLO og 5 μg/mL laminin i NGN2-medie suppleret med 2,5 μg/mL dox. På dag 3 skal du udføre en medieændring (se trin 1.3.) ved hjælp af frisk NGN2-medium, der indeholder 2,5 μg/ml dox og 10 μM DAPT. Efter dag 3 udføres medieændringer hver tredje dag med frisk NGN2-medium, der indeholder 2,5 μg/ml dox, BDNF, GDNF og NT-3 ved 10 ng/ml hver. Billedceller dagligt ved hjælp af metoden “Automatiseret højt indhold, billeddannelse med højt indhold” (se trin 2.5) til overvågning af differentieringsstatus ved hjælp af GFP som udlæsning for neurite udvækst. Indstil lasereffekten til 80 %, og brug en eksponeringstid på 30 ms. Erhverve et stort antal felter (f.eks 25 felter) ved hjælp af 20x mål. Analyse af batchbillede Udfør billedanalyse med billedanalyse software 1, ved hjælp af neurite udvækst skabelon. Åbn softwaren. Vælg indstillingen “Data” og gå til billeddatamappen, klik på ok for at indlæse data, der skal analyseres. Klik på Åbn, og vælg protokol på den øverste menulinje, og vælg neurite outvækst i programmenuen. Gå til “algoritmer” og bruge “488” kanal til at definere kernen, cellekroppen og neurite. Juster tærskelparametrene for hver. Vælg de brønde, der skal bruges til billedanalyse. Klik på linket nederst højreklik, og vælg funktioner, der skal analyseres, f.eks. Fortsæt med “pre-analyze” efterfulgt af “preview”. Kontroller, om eksempelindstillingerne er acceptable, og start analysen i batchtilstand. Resultaterne er tilgængelige i den overordnede mappe under “rapporter” i .csv, der kan åbnes i Excel.BEMÆRK: Billedanalysescript er tilgængeligt efter anmodning. Afbilde gennemsnitlig neuritelængde opnået ved total neuritelængde normaliseret til cellenummer. 5. Automatiseret differentiering af hiPSC i midbrain dopaminerge (mDA) neuroner Manuel hiPSC forberedelse Dissociate 70\u201280% sammenløbet hiPSC i enkelte celler ved hjælp af enkeltcelle dissociation reagens. Inkuber kort celler med enkeltcelleeksklædereserens reagens (100 μL/cm2) i 30 minutter ved 37 °C, opsaml cellesuspension i et konisk rør, centrifuge ved 200 x g i 5 min og resuspenderet cellepellet i iPSC-kulturmedium. Frø 200.000 celler/cm2 på ekstracellulære matrixbelagte 1-brøndsplader og iPSC-kulturmedium suppleret med 10 μM Y-27632. Kulturceller natten over ved 37 °C og 5% CO2. Automatiseret differentiering: Fase 1 Forbered det automatiserede kultursystem som beskrevet i trin 1.1\u20121.2. Belastningskulturplader, der indeholder celler i detautomatiserede kultursystems CO 2-inkubator (se trin 1.5). Forbered KSR-mediet (se Materialetabel)og suppleres med små molekyler (se tabel 2), der kræves til begynderdagen 0 for differentiering. Brug kun frisklavede medier med små molekyler og vækstfaktorer. Udfør medieændringer af kulturpladerne som beskrevet i trin 2.3 på dag 0 og 1 i differentiering og derefter hver anden dag indtil dag 25. Fra dag 5 skifte medieformulering gradvist som beskrevet i detaljer i tabel 3. På dag 11 tilsættes mDA neurondifferentieringsmedium suppleret med CHIR (indtil dag 13), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 og DAPT (se materialetabel ). På dag 25 skal pladerne læsses (se trin 1.6). Manuel replating 1 Dissocier dag 25 mDA prækursorer i enkelte celler ved hjælp af enkelt celle dissociation reagens. Inkuber kort celler med enkeltcelleeksocieringsreage (100 μL/cm2) i 40 minutter ved 37 °C, opsaml cellesuspension i et konisk rør, centrifuge ved 200 x g i 5 min og resuspend cellepellet i mDA neurondifferentieringsmedium. Frø 400.000 celler/cm2 i 1-brønds-kulturplader forbelagt med 0,1 mg/ml PLO 10 μg/mL laminin og 2 μg/mL fibronectin i mDA neurondifferentieringsmed suppleret med 10 μM Y-27632 (indtil dag 26) og små molekyler og vækstfaktorer, der er beskrevet i tabel 2. Kulturceller natten over ved 37 °C og 5% CO2. Automatiseret differentiering: Fase 2 Belastningskulturplader, der indeholder mDA-neuroner, i detautomatiserede kultursystems CO 2-inkubator som beskrevet i trin 1.5 MDA neurondifferentieringsmedium (se materialetabel)klargør dem, og supplere med små molekyler og vækstfaktorer, der er nødvendige for den endelige differentiering fra dag 26 og fremefter (se tabel 2). Udfør medieændringer af kulturplader som beskrevet i trin 2.3 på dag 26 i differentiering og derefter hver 3\u20124 dage indtil dag 65.BEMÆRK: Ved billeddannelse med høj gennemløb anbefales det at genudnævne mDA-neuronerne i 96-brøndplader ved lav tæthed på dag 32 i differentiering, som beskrevet i trin 5.5. Manuel replating 2 Der aflæsser kulturplader som beskrevet i trin 1.6. Dissocier dag 32 mDA neuroner i enkelte celler som beskrevet i trin 5.3.1. Frø 100.000 celler/cm2 i 96-brøndplader forbelagt med 0,1 mg/ml PLO 10 μg/mL laminin og 2 μg/mL fibronectin i mDA neurondifferentieringsmedium suppleret med 10 μM Y-27632 (indtil dag 33) og små molekyler og vækstfaktorer (se tabel 2). Kulturceller natten over ved 37 °C og 5% CO2. På dag 33, erstatte medium med frisklavet DA neuroner differentiering medium suppleret med små molekyler og vækstfaktorer (uden Y-27632). Skift medie manuelt hver 3\u20124 dage indtil dag 65. 6. Immunostaining, automatiseret erhvervelse og analyse af billeder med høj gennemløb Fluorescens farvning Udfør fluorescerende immunstaining som beskrevet i den supplerende fil 1: trin 4. Billedceller som beskrevet i den supplerende fil 1: trin 1.2. Overfør billedfiler, der er genereret af billedbehandlingssystemet, til billedanalysesoftwaren 2 (se Materialetabel)for yderligere billedanalyse som beskrevet i trin 6.2. Billedanalyse ved hjælp af billedanalysesoftwaren 2 Når billedfiler er uploadet i billedanalyse software 2, gå til “billedanalyse” funktion og opbygge analysen algoritme ved hjælp af drop down menuen. Vælg kerner ved hjælp af opgaven “find kerner”, som registrerer områder på billedet, der tilhører cellekerner (her farves med Hoechst). Udeluk kerner fra døde celler (pyknotiske kerner) ved at fastsætte en tærskel for nukleart område eller diameter. Vælg cellecytoplasmaet ved hjælp af opgaven “find cytoplasma”. Denne opgave registrerer regioner omkring kerner, der tilhører celle cytoplasma. Medtag kun godt segmenterede celler. Udeluk mitotiske, apoptotiske og dårligt segmenterede celler. Fjern celler, der rører billedets kant. Tilføj opgaverne “beregne morfologi egenskaber” og “beregne intensitet egenskaber”. Morfologiparametrene omfatter beregning af morfologiegenskaber som f.eks. Intensitetsparametrene omfatter beregning af intensitetsegenskaber såsom middelintensitet for en region af interesse (f.eks. cytoplasma af neuroner). Vælg en delpopulation (f.eks. TH-positive neuroner) af inputpopulationen (alle cytoplasmer valgt) ved hjælp af en eller flere betingelser, morfologi og/eller intensitet.BEMÆRK: Normalt vælges intensitet for neuroner. Baseret på negative kontroller, er det muligt at definere over hvilken tærskel for intensitet neuronerne betragtes som positive for TH. Definer outputresultaterne. Dette er den sidste byggesten i hver analyse. Det definerer analysen udlæsning værdier for hver brønd af en kultur plade (resultater pr brønd). Kør batchanalysen, og eksportér resultaterne. Normalisere antallet af positive celler til det samlede antal kerner og repræsentere data som procentdelen af positive celler. 7. Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qRT-PCR) Udfør qRT-PCR-protokollen som beskrevet i den supplerende fil 1: trin 3.

Representative Results

Vores automatiserede cellekultur og billeddannelsessystem var designet til at minimere menneskelig indgriben, der giver os mulighed for at standardisere dyrkningen af hiPSC og differentiering i forskellige celletyper som kortikal eller midbrain dopaminerge (mDA) neuroner. En skematisk oversigt over vores automatiserede cellekultursystem med integrerede billedbehandlingsenheder er afbildet i figur 1. Den første indførelse af cellekulturer i dette automatiserede cellekultursystem kan enten ske ved automatisk at så celler fra et 50 ml rør eller ved at bruge metoden “Loading Of Culture Plates” eller “Loading of Assay Plates” til import af kultur- eller analyseplader. En central del af vores system er den flydende håndteringsstation, hvor alle væskeoverførselstrin såsom medieændringer eller underdyrkelser udføres. Den specialfremstillede dækslayout for væskehandleren er repræsenteret i figur 2. Væskehåndteringsstationen er udstyret med fire positioner. Op til fire plader kan overføres fra inkubatoren til dækket, så parallelle medieændringer kan ændres. Da både forældre- og datterkulturpladerne i subdyrkningsmetoden skal indkvarteres på dækket, er det maksimale antal kulturplader, der behandles parallelt, begrænset til to. Et vigtigt træk ved væskehåndteringsstationen er muligheden for at vippe pladerne under medieskift for fuldstændig fjernelse af cellekultursupernatant. Også, den flydende håndtering station er udstyret med shakers for at favorisere enzymatisk dissociation af celler under udførelsen af subdyrkning protokol. Vores automatiserede kultursystem er også udstyret med to billeddannelsessystemer: et brightfield-billedcytometer til udførelse af celletællings- og sammenløbskontroller og overvågning af cellevæksten over tid og et dobbelt roterende diskkonfokalt mikroskop til hurtig, høj indhold og billeddannelse i høj opløsning af celler. HiPSC-kulturerne overvåges dagligt for vækst ved brightfield-billedcytometeret og analyseres for procentdel af sammenløb. Brightfield billedet i venstre panel og i højre panel en grøn maske fra analysen af brightfield billede opnået med cytometer (Figur 3A). Der observeres en homogen hiPSC-vækst i tidens løbet, som det fremgår af sammenløbets procentviser af to hiPSC-linjer (n = 4 plader), der dyrkes parallelt og underkastes sammenløbskontrol fra dag 1 til dag 6 (Figur 3B). Når den indstillede tærskel er nået, går hiPSC. Cellelinjerne blev dyrket manuelt (m) eller af automatiseringssystemet (a) og observeret for vedligeholdelse af typisk stamcellemorfologi i mindst to passager, repræsentative brightfield billeder (Figur 4A). Den hiPSC dyrket manuelt (ikke vist) eller i det automatiserede system udstillet den typiske stamcellemarkør OCT4 (rød) og SSEA4 (grøn), som vist i immunfluorescens assay (Figur 4B). Ekspressionen af pluripotency-markerne OCT4, NANOG og REX1 blev også vurderet på mRNA-niveau ved qRT-PCR (Figur 4C). Der blev foretaget relative kvantificeringer med prøver indsamlet fra en cellelinje, der blev dyrket manuelt (m) og i det automatiserede kultursystem (a) i dubletter (replikat 1 og 2). Udtryksniveauerne for alle tre pluripotencymarkører i de replikater, der dyrkes i det automatiserede kultursystem, svarer til markørudtryk efter manuel kultur. På dag 8 (D8) var ekspressionen af pluripotency markører fraværende i kortikale neuroner differentieret (Diff) fra hiPSC. En vigtig anvendelse af det automatiserede kultursystem er differentieringen af hiPSC i forskellige celletyper, herunder neuroner. Her viser vi differentiering af hiPSC i neuroner ved hjælp af NGN2-strategien, som producerer en ren kortikal neuronkultur på meget kort tid (ca. 6 dage). Neuroner differentieret i den automatiserede kultur system (a) præsenterede lignende morfologi og neuronal netværk organisation som neuroner dyrkes manuelt (m) (Figur 5A). Automatiserede differentierede kortikale neuroner var positive for TUBB3 (neuron-specifikke klasse III β-tubulin, rød) og BRN2 (øvre kortikale lag markør, grøn) (Figur 5B), sammenlignes med manuelt differentierede neuroner (data ikke vist). Ekspressionen af neuronale markører, herunder det mikrotubule-associerede protein 2 (MAP2), det neurale cellevedhæftningsmolekyle (NCAM1) og Synapsin-1 (SYN1) samt de kortikale neuronmarkører BRN2 og CUX1 (øverste kortikale lag) blev beriget med neuroner på dag 8 (D8) af differentiering (Figur 5C). Meget lav eller intet udtryk for disse markører blev observeret i hiPSC. Der blev foretaget relative kvantificeringer med prøver indsamlet fra en cellelinje, der blev dyrket manuelt (m) og i det automatiserede kultursystem (a) i dubletter (replikat 1 og 2). Udtryksniveauerne i replikater viser lignende variationer mellem manuelt og automatiseret differentiering. Den automatiserede kultursystems integrerede billeddannelsesevne giver mulighed for håndfri dataindsamling for kulturens sundhed, hvilket muliggør langsigtet automatiseret erhvervelse af fænocypiske udlæsninger. Ved hjælp af NGN2 tilgang til et lille molekyle afledt neurale forløber (smNPC) linje transduced med GFP lentivirus, vi etableret en levende celle automatiseret neurite udvækst assay, hvor neurite længde blev målt over 11 dages differentiering uden manuel indgriben. Neurite-kompleksiteten steg over tid, som det fremgår af det område, der var besat af neuritter på dag 1, 3 og 11, GFP-udtryk og maskerede billeder fra analyse (Figur 6A, B). Stigningen i neurite længde fra dag 1 til 11 af differentiering blev kvantificeret og viste en lignende udvikling på tværs af forskellige brønde. For nemheds skyld er data fra kun 3 kolonner med 6 brønde hver fra en 96-brøndplade afbildet i den repræsentative graf, selv om alle indre 60 brønde blev analyseret (Figur 6C). En anden anvendelse af den automatiserede kultur system vist her er differentiering af hiPSC i mDA neuroner. Differentieringen er baseret på medieændringer efter en foruddefineret protokol og blev udført på det automatiserede kultursystem fra dag 0 til 65. Automatiserede medieændringer vidste ikke, at celleafrivelse eller andre visuelt kan påvises ændringer i differentieringen. Ved afslutningen af differentiering, på dag 65, mDA neuroner viser cellulære organisation og morfologi (sfærisk soma, lang og spiny dendrites) kan sammenlignes med manuel differentiering (Figur 7A, B). På mRNA-niveau viser mDA neuroner differentieret i det automatiserede kultursystem ekspressionen af neuronale og mDA-markører, MAP2 og TH (tyrosinhydrxylase), henholdsvis (Figur 7C). Begge differentieringer genererede betydelige mængder af TH og MAP2 positive neuroner (Figur 7D). Figur 1: Skematisk overblik over den automatiserede cellekultur og billedplatform.Systemet er designet med et polycarbonathus og to HEPA-emhætter (A og B) udstyret med fire UV-lamper, der sikrer et sterilt miljø for cellekulturapplikationer. Cellekulturplader læsses på hylderne foran robotarmen, som kan tilgås via hoveddøren (C). Pladerne indlæses i CO2-inkubatoren (D) med en kapacitet på 456 plader. Et brightfield celle cytometer (E) bruges til sammenløb kontrol og celletælling under subopdyrkning rutiner. Væskehåndteringsstationen er under en af HEPA-emhætterne (B). Dækslayoutet for væskehandleren er beskrevet i figur 2. Den pipettering arm af flydende håndtering station bærer en 96 kanal pipettering hoved, otte 1 ml pipettering kanaler og fire 5 ml pipettering kanaler. I tilfælde af 1 ml pipetteringskanaler kan spidser eller nåle anvendes til væskeoverførsler. Til screeningsformål kan celler, der er seedet i analyseplader, behandles med prøver, der opbevares ved -20 °C i det automatiserede -20 °C-lagersystem (F), efter at disse prøver er optøet i en anden inkubator (G). Høj overførselshastighedsscanning udføres i det automatiske konfokale mikroskop (H), der tilbyder at erhverve billeder i konfokal tilstand ved hjælp af to roterende diske eller i epifluorescenstilstand. En levende celle kammer integreret i mikroskopet giver mulighed for at udføre langsigtede billeddannelse af dyrkede celler. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Dækslayoutet for væskehåndteringsstationen.Spidspositioner angives med “50 μL” for 50 μL spidser, med “standard” for 300 μL spidser, ved “høj” for 1 ml spidser og med “5 ml” for 5 ml spidser. Dækkomponenter: ( A )Fireopvarmede shakerpositioner (max hastighed: 2500 omdr./min.), som kan bruges til enhver kulturplade eller analysepladeformat. Shakerpositionerne er udstyret med fastspændte gribere, som også bruges til pladejustering efter transporter til dækket. Desuden fungerer rystende positioner som lågparkeringsposition for plader under væskeoverførselstrin. Til repræsentative formål, er alle shaker positioner besat af 96 godt assay plader. (B) Fire vippemoduler til behandling af fire plader i et format samtidigt er placeret øverst. Den laveste position markerer affaldsindsamlingskammeret for kultur- og analyseplader og 96-kanals rørhovedet. Til repræsentative formål, er alle tilt moduler besat af 96-godt analyseplader. (C) På den øverste position er 384-brøndpladen til celletælling placeret. Nedenfor er to positioner for plader, der er besat af 96-brønd plader til repræsentative formål og en rack til fire 50 ml og fire 15 ml rør. Den laveste position er besat af 5 ml spidser. D) Tre medielinjer med positioner for mediereservoirer. Medielinjerne har væskeniveausensorer, der gør det muligt automatisk at fylde mediebeholderen med op til 250 ml medie. (E) To væskeaffaldsmoduler med aktivt afløb er baseret på toppen, under et temperaturstyret modul med en position til en beholder (hvid) og et 5 ml tip rack er placeret. (F)Fem positioner for 1 ml spidser. (G) To temperaturstyrede moduler er placeret i bunden og en position til parkering af et af deres låg på toppen. (H) Positioner for to 50 μL indlejrede spidsstativer (NTR) i toppen efterfulgt af to positioner for enkeltkanal- og 96-kanals op- og 300-kanals spidser og et 5 ml tipstativ i bunden. (I) En stabler til 384-brøndtællingsplader øverst efterfulgt af tre 300 μL NTR og et 5 ml tip-rack i bunden. (J) Opbevarings- og vaskestation i tre sæt af otte genanvendelige 1 ml-nåle. k)Affaldsposition for 1 ml og 5 ml rørkanaler og tomme NTR (grå) samt en griberblok til 1- og 5 ml-kanaler (hvid), der anvendes til transporttrin på dækket. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: Automatiseret sammenløbskontrol af hiPSC.a)repræsentative brightfield -billeder (BF) af hiPSC taget af cellecytometeret (til venstre) og efter automatiseret sammenløbsanalyse (til højre), der angiver det proportionale område, der er besat af celler i grønt; b) Sammenløbsprocenter, der registreres fra to hiPSC-linjer (iPS #1 og #2) fra kulturens dag 1 til 6, n = 4 1-brøndsplader pr. cellelinje. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: Viderebringning af hiPSC.(A) BF billede af en hiPSC linje dyrkes manuelt (venstre) og ved hjælp af den automatiserede kultur system (højre). Billeder blev taget 6 dage efter den anden passaging; b) Repræsentative billeder af hiPSC, der er bejdset for pluripotency-markørerne OCT4 og SSEA4, og som er kontrafet med Hoechst 33342 (Nuclei); c) Resultater af qRT-PCR for pluripotency-markørerne OCT4, NANOG og REX1 i én hiPSC-linje dyrket i dupliker (1 og 2) manuelt (m) og i det automatiserede kultursystem (a) og de respektive hiPSC-afledte kortikale neuroner (Diff) på dag 8 (D8) for differentiering. Dataene repræsenteres som det relative antal (RQ) ved hjælp iPS_a_1 som referenceeksempel. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (SD) fra 3 tekniske replikater af qRT-PCR-reaktion. GAPDH, RPL13A1 og RPLPO blev brugt som rengøringsgener. Skalabar: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5: Humane iPSC-afledte kortikale neuroner.(A) Brightfield billeder af dag 6, manuelt (m) og automatiseret (a) differentieret kortikale neuroner viser lignende neuronal netværk; b) repræsentative billeder af celler, der er bejdset for TUBB3 (pan neuronal), BRN2 (kortikale neuroner) og Hoechst 33342 (kerner) på dag 8 i differentiering; c) Resultater af qRT-PCR for markørgener af kortikale neuroner (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 og SYN1) beriget med differentieringsdagen 8 (D8). Dataene repræsenteres som det relative antal (RQ) ved hjælp iPS_a_1 som referenceeksempel. Fejllinjer repræsenterer SD fra 3 tekniske replikater af qRT-PCR-reaktion. GAPDH, RPL13A1 og RPLPO blev brugt som rengøringsgener. Skalabar: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 6: En høj-throughput assay for neurite udvækst.a) repræsentative billeder af GFP, der udtrykker celler på differentieret dag 1, 3 og 11 (B) Repræsentative binære billeder af neuritter på dag 1, 3 og 11 i differentiering. Neurite udvækst blev kvantificeret ved hjælp af det høje indhold billede analyse software 1 og er repræsenteret som neurite længde; (B) Grafikken viser stigningen i neurite længde i NPC-afledte NGN2 neuroner og dannelse af et tæt netværk. Tre 96-brønds plader med celler i de indre 60 brønde er afbildet. For nemheds skyld vises kun tre kolonner af brønde pr. 96-brøndplade som et eksempel med n = 6 brønde pr. kolonne. Et gennemsnit på 1308 celler blev analyseret pr. brønd. Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i middelværdien (S.E.M.). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 7: Humane iPSC-afledte mDA neuroner.Midbrain DA neuroner differentieret manuelt (m) og i den automatiserede (a) kultur system. a, B) Repræsentative fluorescerende billeder af mDA neuroner farves for tyrosin hydroxylase (TH, mDA neuron markør; grøn), MAP2 (neuronal markør; rød) og Hoechst 33342 (kerner; blå); c) Repræsentative qRT-PCR-resultater for markørgener af mDA-neuroner, der er differentieret manuelt og i det automatiserede kultursystem. TH- og MAP2-ekspressionsniveauer repræsenteres som relativ mængde (RQ), der normaliseres til rengøringsgener (OAZ1 og GAPDH) d)Procentdele af TH- og MAP2-positive neuroner, der genereres ved manuel og automatiseret differentiering. Fejllinjer repræsenterer SD for to uafhængige differentieringer, der udføres med to forskellige iPSC-linjer (#1 og #2). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. Celletype Formål Protokoltrin Celletæthed Pladeformat Cellenummer/brønd NGN2-differentiering Ipsc NGN2 stabil linjeproduktion S.2.3. 30.000 celler/cm2 12-godt 1,17,000 Ipsc NGN2 neuron differentiering 3.1.3. 30.000 celler/cm2 1-brønd 25,20,000 Ipsc NGN2 neuron differentiering 3.1.3. 30.000 celler/cm2 96-godt 9,600 smNPC generation smNPC Genudlækningsdag 12 og 16 S5.9. og S5.11. 70.000 celler/cm2 6-godt 6,72,000 smNPC Replating fra passage 5 5.11. 50.000 celler/cm2 6-godt 4,80,000 smNPC smNPC til NGN2 neuroner 3.2.2 50.000 celler/cm2 96-godt 16,000 mDA-differentiering Ipsc mDA neuron differentiering 4.1.2. 200.000 celler/cm2 1-brønd 1,68,00,000 DA neuroner Dag 25 replating 4.3.2. 400.000 celler/cm2 1-brønd 3,36,00,000 DA neuroner Dag 25 replating 4.5.2. 100.000 celler/cm2 96-godt 32,000 Belægning Formål Protokoltrin Koncentration/Fortynding Pladeformat Nærmere oplysninger om belægning iPS-kultur Ekstracellulær matrix iPSC, NGN2 line,mDA neuroner 1.5.7. og S2.3. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 1-/12-brønd 8/0,5 ml/brønd; 1 time hos RT NGN2-differentiering Poly-L-Ornithin NGN2 neuron differentiering 3.1.3. og 3.2.2. 0,1 mg/ml Pbs 1-/96-godt 8/0.1 ml/brønd; 12 timer ved 37°C;3x PBS vask Laminin NGN2 neuron differentiering 3.1.3. og 3.2.2. 5 μg/ml Pbs 1-/96-godt 8/0.1 ml/brønd; 4 timer ved 37°C smNPC generation Ekstracellulær matrix smNPC generation og kultur S5.6., S5.9.,S5.11. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 6-godt 1 ml; 2 h hos RT mDA-differentiering Ekstracellulær matrix mDA-differentiering 4.1.2. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 1-brønd 12 ml; 12 timer ved 37°C Poly-L-Ornithin mDA-differentiering 4.3.2. og 4.5.2. 0,1 mg/ml Pbs 1-/96-godt 12/0.1 ml/brønd;12 timer ved 37°C; 3x PBS vask Laminin mDA-differentiering 4.3.2. og 4.5.2. 10 μg/ml; Pbs 1-/96-godt 12/0.1 ml/brønd; 12 timer ved 37°C Fibronectin mDA-differentiering 4.3.2. og 4.5.2. 2 μg/ml Pbs 1-/96-godt 12/0.1 ml/brønd; 12 timer ved 37°C *En ekstracellulær matrix aliquot defineres som fortyndingsfaktoren (i μL), der findes i analysecertifikatet for dette produkt. Tabel 1: Henholdsvis seedningscelletæthed og belægning i pladeformatet. Dag Reagens Dag 0 – 1 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 Dag 1 – 3 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine100ng/ml FGF-8b Dag 3 – 5 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine100ng/ml FGF-8b, 3 μM CHIR99021 Dag 5 – 7 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorphamine, 100ng/mLFGF-8b,3 μM CHIR99021 Dag 7 – 9 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 Dag 9 – 11 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 Dag 11 – 13 3 μM CHIR99021, 20 ng/ml BDNF, 0,2 mM L-ascorbinsyre (AA1), 20 ng/mlGDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT Dag 13 – 65 20 ng/ml BDNF, 0,2 mM L-ascorbinsyre (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP1 ng/ml TGFß3, 10 μM DAPT Tabel 2: Lille molekyletilsætning til dopaminerge neurondifferentiering. Dag KSR-medie N2-medie Differentieringsmedium Dag 0 – 1 100% 0 0 Dag 1 – 3 100% 0 0 Dag 3 – 5 100% 0 0 Dag 5 – 7 75% 25% 0 Dag 7 – 9 50% 50% 0 Dag 9 – 11 25% 75% 0 Dag 11 – 13 0 0 100% Dag 13 – 65 0 0 100% Tabel 3: Mediegradient for dopaminerge neurondifferentiering. Supplerende sag 1. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Vi introducerer et automatiseret cellekultursystem med integrerede billeddannelsesfunktioner til standardisering af hiPSC-kultur og neuronal differentiering. På grund af minimal brugerindgriben er eksperimentel variation lav sikring af reproducerbarheden af cellulære fænotyper under differentiering. Den kalenderbaserede planlægger understøtter tilrettelæggelsen og paralleliseringen af eksperimenter og giver mulighed for en høj grad af fleksibilitet, hvorefter forsøgene udføres. De eksisterende metoder kan let tilpasses, og spektret af tilgængelige metoder kan øges. Derudover kan et stort antal analyse plade formater bruges tilføje til fleksibiliteten i dette system. Det minimale system bestående af en CO2-inkubator, en robotarm, et lyst cellecytometer og en flydende håndteringsstation udgør den grundlæggende enhed, der er nødvendig for hiPSC-kultur og -differentiering, med overkommelige omkostninger til akademiske forskningslaboratorier. Kombinationen af det automatiserede cellekultursystem med et automatiseret -20 °C lagersystem til opbevaring af forbindelser, RNAi biblioteker eller CRISPR/Cas9 biblioteker, og integrationen af et højt indhold/høj-throughput mikroskop muliggør udførelse af fænotopypiske screeninger.

I den aktuelle undersøgelse brugte det automatiserede cellekultursystem engangstips, og kulturmediet blev genopfyldt manuelt i reservoiret, hvilket begrænsede brugen af væskehåndteringsstationen til medieændringer og andre kulturprocesser, især natten over. For at omgå denne begrænsning kan metoderne justeres til nålebrug i stedet for engangsspidser, og efter installation af rørforbindelser mellem medielinjer og medieposer, der er lagret i et køleskab, kan mediereservoirer automatisk genopfyldes med friske medier, der er forvarmet af varmelegemende elementer. Dette vil reducere brugerforstyrrelser forårsaget af manuel genopfyldning af tips, kulturmedier og reservoirudvekslinger.

Vores automatiserede cellekultursystem giver flere fordele. Den ene er stregkodesporingssystemet. Pladerne, der er indlæst i systemet, identificeres ved hjælp af en unik stregkode, som læses og gemmes af systemet, hvilket gør det muligt at spore prøver under og efter metodudførelse. En anden fordel er muligheden for at oprette brugerspecifikke projekter. Her kan kulturplader, der er indlæst i systemet, tildeles til et bestemt projekt og grupperes i batches. Strukturering i partier forenkler udførelsen af den samme procedure til alle plader af et bestemt parti, da der ikke er behov for at vælge individuelle plader. Derudover gør en flydende klasseeditor det muligt at justere pipetteringshastigheden og -højden samt aspirations- og dispenseringsparametrene for hvert væskeoverførselstrin. Hver proces er dokumenteret i logfiler gør det muligt at spore hvilke opgaver er blevet udført for en given kultur eller analyse plade.

Neuroner og andre celletyper fremstillet af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er nyttige in vitro-værktøjer til at studere mekanismerne i neurodegenerative sygdomme i specifikke patientpopulationer (f.eks. dopaminerge neuroner mod Parkinsons sygdom), hvilket giver mulighed for personlige lægemiddelscreeninger. Culturing hiPSC er meget tidskrævende og kræver uddannede mennesker til at udføre komplekse differentiering protokoller, normalt begrænset til lav skala produktion. Vi tilpassede hiPSC’s feeder-fri kultur til en automatiseret kultur og implementerede to neuronaldifferentieringsprotokoller, en hurtig kortikal neurondifferentieringsprotokol baseret på NGN2 overudtryk under en tet-on promotor10,11og en langsigtet lille molekylebaseret protokol til generering af midbrain dopaminerge (mDA) neuroner13. Den enkle overførsel og reproducerbarhed af manuel kultur og differentieringsprotokoller gør det automatiserede kultursystem meget nyttigt. Human iPSC dyrket i det automatiserede cellekultursystem viste konsekvent stamcellemorfologi og udtrykte vigtige pluripotency markører, reproducerbare mellem uafhængige eksperimenter. Desuden favoriserede automatiseringen af hiPSC-kulturprotokollen kulturen og udvidelsen af et større antal cellelinjer parallelt. Automatiseret sammenkoblingskontrol, der er planlagt til at blive udført natten over, sparede tid på at lade systemet være frit i løbet af dagen for de efterfølgende procestrin, der blev udført, da brugeren var i laboratoriet (f.eks. høst af celler eller manuel replating til differentiering). Når cellerne når den brugerdefinerede sammenløbstærskel, oversendes og genindlægges de i ekstracellulære matrixbelagte plader, der er tilgængelige på stableren i det automatiserede cellekultursystem. Hver passage runde tager omkring 70 min og genererer fire 1-brønd plader fra en forælder plade, hvilket svarer til en kapacitet på 20 passager på en dag.

Automatiseringen af NGN2-differentieringsprotokollen blev udført med succes og gjorde det muligt at skabe en homogen population af neuronale celler på tværs af forskellige passager og sammenlignes med manuelle differentieringer. Desuden vil de eksperimentelle omkostninger til storstilede screeningsundersøgelser, der omfatter flere cellelinjer eller screeningsforsøg med tusindvis af testbetingelser/-forbindelser, blive reduceret på grund af hurtige differentieringer. Omkostningseffektive og høj-throughput udlæsninger, herunder levende-celle neurite outgrowth målinger kan let udvikles, gennemføres og anvendes som fænotopypiske udlæsninger til sygdom modellering, som vist tidligere14,15,16. Således har vi yderligere tilpasset NGN2-protokollen ved hjælp af små molekyle afledt neurale forløber (smNPC) celler, der konstituerende over-ekspres GFP. SmNPC-cellerne giver yderligere fordele, herunder reducerede omkostninger med kulturmedier (en tredjedel af omkostningerne med iPSC-kultur) og den tid, der kræves for at opskalere eksperimenter. Celleudbyttet fra smNPC er 7 til 10 gange højere end den, der opnås med iPSC. De differentierende neuroner blev overvåget og afbildet i flere dage ved hjælp af en fuldautomatisk billeddannelsesproces uden behov for manuelle antistoffarvninger eller kemisk mærkning, hvilket sparede omkostninger og tid, der kræves til manuelle procedurer, herunder billeddannelse i sig selv. Den nuværende billeddannelse af indre 60 brønde af en 96-brønd plade tager omkring 16 min per plade, når 25 felter pr brønd er afbildet, hvilket betyder, at data for en billedbehandling-baseret screening for 1000 forbindelser, kunne erhverves og analyseres på en dag. I fremtiden kan denne udlæsning anvendes i sammensatte screeningsundersøgelser til redning af neurite udvækstdefekter.

Endvidere demonstrerer vi også overførslen af en manuel differentieringsprotokol til generering af midbrain dopaminerge (mDA) neuroner fra iPSC. Denne lille molekyle-baserede differentiering protokol tager 65 dage og er arbejdskrævende på grund af de mange replating trin og hyppige medieændringer, for det meste hver 2 dage, hvilket begrænser produktionen af mDA neuroner til få iPSC linjer på samme tid. Den automatiserede mDA-differentieringsprotokol har den store fordel at opskalere differentieringen til snesevis af iPSC-linjer. Op til 30 cellelinjer kan differentieres parallelt. Da differentieringen for det meste er baseret på medieændringer, kan næsten hele differentieringsprocessen udføres uden menneskelig indblanding. Ved hjælp af den kalenderbaserede planlægger af det automatiserede system kunne vi planlægge medieændringerne i henhold til differentieringstrinnene. En begrænsning af arbejdet med et så stort antal cellelinjer og kulturplader var det umuligt at udføre dag-til-dag medieændringer. Den væsentligste årsag er, at vores system er sat op til brug af engangstips og manuel genopfyldning af kulturmedier, der kræver en bruger i laboratoriet til at udføre dette manuelle trin. For at lette medieændringsprocessen blev plader, der blev indlæst i systemet, tildelt til et projekt og grupperet i batches. Batchstørrelsen blev derefter tilpasset antallet af engangstips og mængden af kulturmedier, der var til rådighed. Som beskrevet ovenfor kan denne begrænsning let overvindes ved implementering af genanvendelige/vaskbare nåle og automatiseret genopfyldning af medier. Automatiseret aflevering/replating af celler, som vist for iPSC, er en af de bekvemmeligheder, der tilbydes af vores automatiserede cellekultursystem. Vi har testet den automatiserede replating af mDA neuroner på dag 25 af differentiering. Dissociationen af mDA-neuroner kræver dog længere (40 min) inkubation med dissociationsenzymet end iPSC (8 min) og udvider den automatiserede replatingsproces til mere end 1 time pr. cellelinjer. Som følge heraf blev den automatiserede replating af 30 cellelinjer på samme dag umulig. Fremskynde andre trin under automatiseret replating (transport af plader, pipettering) og tilpasning af systemet til brugen af nåle og medier linje, der gør en overnatning arbejde muligt ville løse denne begrænsning. På trods af ulemperne kunne vi med held overføre den manuelle protokol til en automatiseret differentiering af mDA neuroner, der producerer kulturer med betydelige mængder MAP2 (neuron) og TH (mDA neuroner) positive celler.

Differentiering snesevis af iPSC cellelinjer parallelt er af stor interesse i projekter, der undersøger de molekylære mekanismer af neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom. Men at udføre opgaver hurtigere med færre fejl og til reducerede omkostninger er en stor udfordring. På grund af automatiseringen af de protokoller, der præsenteres her (iPSC, smNPC og mDA neuron), kunne vi fremskynde, reducere omkostningerne og øge reproducerbarheden i vores projekter. Udviklingen af projekter som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/), der involverer hundredvis af patientcellelinjer, viser behov for automatiseret kultur og differentieringsprotokoller. Vores fremtidige perspektiver omfatter overførsel af manuelle 3-dimensionelle (3D) cellekulturmodeller til det automatiserede system. Mindre tilpasninger i pladedefinitionsindstillingerne og brug af adaptere vil gøre det muligt at anvende kommercielle eller specialfremstillede plader og mikrofluidiske kamre, der er nødvendige for 3D-kulturerne. Desuden vil gennemførelsen af en automatiseret etiketfri billeddannelsesmodel give os mulighed for at spore neuronal vækst i realtid og omsætte ændringer i neurite udvækst, neuron organisation og celledød i bedre forståelse af sygdommen mekanismer.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne taknemmeligt anerkende patienter og deres familier, der bidrog biomateriale til denne undersøgelse. De celler, der blev anvendt i undersøgelsen, var fra NINDS-samlingen med Rutgers (ND41865 som iPS#1) og laboratoriet for Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Dette arbejde støttes delvis af NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, et fælles EU-program – Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, et ERA-Net ERACoSysMed-finansieret projekt (PH) og Foundational Data Initiative for Parkinsons Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD er en del af The Michael J. Fox Foundation’s PATH to PD program. Forfatterne takker Steven Finkbeiner og Melanie Cobb (Gladstone Institutes) for at bidrage til etableringen af den manuelle mDA neuron differentiering protokol og Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) for bistand i neurite udvækst analyse setup.

Materials

Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 – 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons – NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons – SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons – N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons – Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Payne, N. L., Sylvain, A., O’Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
  3. Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
  4. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  5. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
  6. Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
  7. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
  8. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
  9. Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
  10. Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
  13. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  14. Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
  15. Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
  16. Mehta, S. R., et al. Human Huntington’s Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
  17. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
  18. Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, 792 (2010).

Tags

Keywords: Automated ProductionHuman Induced Pluripotent Stem CellsCortical NeuronsDopaminergic NeuronsLive-cell MonitoringStandardized ProceduresLow Experimental VariationHigh Phenotypic ReproducibilityGraphic User InterfaceResource Instrument ProcessHEPA HoodDecontaminationUV RadiationLiquid Handling StationCulture MediumDissociation ReagentCell LineProjectBatchSeedingBrightfield Imaging CytometerCell Counting
check_url/pt/61525?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image