Un approccio di dissociazione a singola cellula per l'analisi molecolare della vescica urinaria nel topo dopo la lesione del midollo spinale

Le procedure sono state eseguite in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Animal Care and Use Committee del Boston Children’s Hospital. NOTA: I topi erano ospitati in una struttura animale accreditata AAALAC con accesso ad libitum a cibo e acqua. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi femmine a 8\u201212 settimane di età. Data la natura della lesione, è stato fornito un ulteriore arricchimento nutrizionale ai topi per garantirne il benessere. 1. Trasezione del midollo spinale a basso toracico nei topi Preparazione prima della trasezione del midollo spinaleNOTA: Gli strumenti chirurgici necessari per questa procedura sono le forbici a molla microsezionanti, le pini di microsezionatura, il driver dell’ago micro suturante, gli emostati e le suture di poliglatina 910 7-0. Altre forniture chirurgiche richieste sono tende chirurgiche, fogli sterili per campo chirurgico, spugne di garza, applicatori a punta di cotone e siringhe da 1 ml con aghi da 25 G. Autoclavare gli strumenti chirurgici e le forniture prima dell’intervento chirurgico. Pulire l’area chirurgica e le pastiglie riscaldanti con salviette alcoliche. Una pastiglia riscaldante verrà utilizzata durante l’intervento chirurgico e l’altra per l’immediato periodo postoperatorio per mantenere la temperatura corporea dell’animale fino a riconquistare la piena attività. Utilizzare loupes ingrandinti (2,5x o più) per eseguire la procedura chirurgica. Accendere le pastiglie di riscaldamento, la fonte di luce e lo sterilizzatore di perline di vetro per essere pronti per l’uso durante la procedura. Aprire le tende chirurgiche e gli strumenti. Utilizzare guanti sterili per drappeggiare il campo chirurgico e posizionare gli strumenti nel campo chirurgico. Preparazione degli animali Porta i topi nella sala procedure e porta anche una gabbia pulita per i topi feriti del midollo spinale. Somministrare l’anestesia posizionando il mouse nella camera di induzione con flusso di isoflurane impostato al 3,0%, flusso di ossigeno a 1 L /min e aspirazione a 20 mmHg fino a quando non vi è risposta paw-pinch. Pesare immediatamente l’animale e quindi posizionare l’animale in posizione soggetta alla protezione sulla pastiglia riscaldante. Posizionare il cono anestetico comodamente sul naso del topo, passare il flusso di gas dalla camera di induzione al cono del naso e impostare il flusso di isoflurane al 2% e il flusso di ossigeno a 1 L /min. Confermare che l’animale è adeguatamente anestetizzato con l’assenza di risposta al paw-pinch. Nastro gli arti animali sul pad riscaldante. Posizionare un pezzo arrotolato di spugna di garza sotto il petto inferiore per elevare e flettere le vertebre toraciche inferiori. Applicare lubrificante oftalmico su entrambi gli occhi. Somministrare antidolorifici (Meloxicam, 10 mg/kg, per via sottocutanea) e antibiotici (Enrofloxacina, 5 mg/kg, per via sottocutanea).NOTA: Gli utenti finali devono utilizzare i farmaci antidolorifici e gli antibiotici raccomandati dal loro comitato locale per la cura e l’uso degli animali. Palpare il processo spinoso più prominente nella colonna vertebrale toracica che in genere corrisponde al processo spinoso T137. Radere un’area rettangolare longitudinale sul retro del mouse dal collo inferiore a appena sotto il processo spinoso più prominente (T13) e per 1 cm su ciascun lato della linea mediana. Procedura chirurgica Prepa l’area rasata con soluzione di iodio povidone al 10% e 70% di etanolo tre volte in alternativa in modo circolare partendo dal sito di incisione lavorando verso l’esterno e quindi coprire l’animale con sterile spugna di garza 4 x 4 con una finestra al centro sovrascriva il campo chirurgico. Fai un’incisione di 1,5 cm nella linea mediana della schiena usando forbici fini che terminano nel processo spinoso più prominente (T13). L’incisione dovrebbe includere la pelle e la fascia superficiale. L’uso di forbici separa la pelle e la fascia superficiale su entrambi i lati per esporre i processi spinosi e i muscoli paraspinosi circostanti. L’uso di dissezione acuta e smussata separa i muscoli dai processi spinosi e dalle laminae delle vertebre T9, T10 e T11. Dividere nettamente i legamenti interspinosi tra T9 e T10 e tra T10 e T11 usando forbici fini e quindi asportare il processo spinoso di T10 ed eseguire attentamente la laminectomia T10 bilateralmente per esporre il midollo spinale. Assicurarsi che le lamina siano completamente asportate. Traseleggi il midollo spinale usando forbici fini. Il sanguinamento minimo di solito si verifica a questo punto a causa della trasezione dei vasi del midollo spinale. Comprimere l’area di sanguinamento con un applicatore sterile con punta di cotone per ottenere l’emostasi. Dopo aver confermato l’emostasi completa, chiudere la pelle con 7-0 poliglactina 910 suture continue. Somministrare 1 mL di soluzione salina per via sottocutanea per prevenire la disidratazione postoperatoria. Cure postoperatorie Posizionare l’animale su una pastiglia riscaldante fino al completo recupero, quindi trasferirlo in una gabbia solo per i topi feriti del midollo spinale. La cura postoperatoria include l’osservazione e la pesatura quotidiana degli animali e il monitoraggio del sito di incisione per i segni di infezione per un massimo di 7 giorni. Somministrare 1 mL di soluzione salina, analgesico (meloxicam 10 mg/kg) e antibiotico (enrofloxacina 5 mg/kg) tutti per via sottocutanea al giorno per 3 giorni.NOTA: Gli utenti finali devono utilizzare i farmaci antidolorifici e gli antibiotici raccomandati dal loro comitato locale per la cura e l’uso degli animali. Eseguire l’espressione manuale della vescica (manovra credé) ogni 12 ore fino a quando l’animale non è in grado di urinare da solo (di solito in 10-14 giorni). Tenere l’animale con una mano e massaggiare l’addome inferiore con l’altra mano, quindi sentire e comprimere delicatamente la vescica urinaria distesa con l’indice e il pollice. Una delicata compressione transitoria dovrebbe alternarsi al rilassamento. Seguendo l’espressione manuale, lavare l’addome inferiore con acqua del rubinetto e asciugare delicatamente con un tovagliolo di carta senza strofinare esente.NOTA: Una piccola dimensione della vescica prima dell’inizio dell’espressione e bagnatura dell’addome inferiore con urina sono indicazioni che l’animale ha acquisito la capacità di annullare da solo. Per ridurre al minimo la perdita di peso, fornire arricchimento nutrizionale ai topi sotto forma di gel nutritivo e altre prelibatezze nutrienti (frullati di pancetta, croccanti di frutta e morsi di verdure) poste sul pavimento della gabbia per un facile accesso NOTA: In questo studio, i topi sono stati perfusi e le vesciche procurate a 8 settimane dopo SCI. Complicazioni postoperatorie Ridurre al minimo il potenziale di rottura della vescica a causa dell’espressione della vescica manuale troppo zealosa non esprimendo completamente la vescica. Prevenire l’escoriazione della pelle perineale dall’esposizione continua al dribbling delle urine dallo sfintere incompetente attraverso il lavaggio della regione perineale con acqua del rubinetto. Ridurre al minimo l’infiammazione attraverso l’applicazione di unguento triplo antibiotico.NOTA: L’ostruzione uretrale dovuta al coagulo di sangue durante il periodo di ematuria transitoria o al coagulo di sperma a causa dell’eiaculazione retrograda nei topi maschi può verificarsi a seguito di lesioni del midollo spinale. L’ostruzione uretrale completa nei topi maschi spesso culmina nella rottura e nella morte della vescica. Nella nostra esperienza la frequenza dell’ostruzione uretrale nei topi maschi che ha portato alla morte è stata del 10%. 2. Approvvigionamento di perfusioni e tessuti NOTA: Per le analisi a valle di alcuni tipi di cellule come le cellule immunitarie nei tessuti periferici è utile rimuovere il sangue per perfusione al momento della raccolta dei tessuti, come descritto di seguito. Somministrare l’anestesia come menzionato nella procedura chirurgica (fase 2.2) e confermare che l’animale è adeguatamente anestetizzato senza risposta forepaw-pinch (l’animale è paraplegico, quindi gli arti posteriori hanno diminuito la sensazione e la risposta del pizzico di zampe posteriori diventa irrilevante). Posizionare l’animale in posizione supina e tamponare l’addome e il torace con il 70% di etanolo per bagnare la pelliccia per evitare che entra nel sito operativo. Eseguire una laparotomia della linea mediana dal bacino al diaframma. Tagliare il diaframma lontano dalle costole.NOTA: Dopo questo passaggio, la velocità è importante poiché il differenziale di pressione toracica non esiste più e i polmoni non possono gonfiarsi, quindi l’animale inizia a soffocare. Tagliare il torace aperto lungo le costole sul lato sinistro e destro seguendo il bordo della cartilagine ossea su una linea parallela allo sterno, iniziando al diaframma e procedendo fino alla prima costola. Posizionare la parete toracica anteriore completa sopra la testa dell’animale e fissarla in questa posizione utilizzando morsetti per asciugamani. Non tagliare la parete toracica anteriore in quanto ciò causerà un grave sanguinamento dalle due arterie toraciche interne. Tagliare il pericardio usando forbici fini. Collegare un ago da 23 G all’apparato perfusionale, quindi inserirlo nel ventricolo sinistro e lentamente nell’aorta, facendo attenzione a non forarlo.NOTA: L’apparecchio perfusione comprende una pompa perfusione e una siringa da 50 ml collegata a tubi per via endovenosa. Inizia la perfusione e fai rapidamente un piccolo taglio con la punta delle forbici fini nell’atrio destro per il drenaggio. Fare attenzione a non introdurre bolle d’aria durante l’infusione di liquidi. Eseguire la perfusione con soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) eseguita a 15 mL/min. La perfusione è completa quando si ottiene un drenaggio chiaro e schiareto del fegato (Figura 1).NOTA: Il tempo medio per la perfusione è stato di 3,5-4 minuti. La perfusione inadeguata si manifesta come lenta progressione dello sbiancamento dei tessuti e di solito è dovuta a un posizionamento errato dell’ago nel ventricolo sinistro. La regolazione dell’ago e l’estensione della durata della perfusione da 1 a 2 minuti garantiranno un’adeguata perfusione dei tessuti. Interrompere la perfusione e sezionare la vescica libera dai pedicoli vascolari e dall’uretra e posizionarela in un tubo di microcentrifugo contenente la soluzione di Tyrode ghiacciata. 3. Digestione della vescica urinaria in controllo e dei topi feriti dal midollo spinale NOTA: Al fine di formulare un’efficiente miscela di digestione su misura per la vescica urinaria del topo abbiamo cercato di regolare l’unità di enzimi utilizzati per degradare i componenti predominanti della matrice extracellulare come collageni e acido ialuronico. Pertanto, abbiamo utilizzato i dati di sequenziamento dell’RNA disponibili pubblicamente generati dal progetto Mouse ENCODE (BioProject: PRJNA66167) per estrarre letture per kilobase per milione (RPKM) e Tabula Muris8 per la valutazione dell’espressione spaziale all’interno della vescica. I collageni 1, 3 e 6 sono stati i tre geni più espressi tra 42 collageni diversi (Figura 2A). L’espressione di tali collageni e ialurona sintasi 1 (Has1) è stata osservata principalmente nelle cellule muscolari e nei fibroblasti della parete vescicale (Figura 2B). Preparazione di tamponi e soluzioni Preparare la soluzione di tirodo di sodio secondo la tabella 1 in una bottiglia pulita da 500 ml. Aggiungere 300 mL di ddH2O. La soluzione è acida dopo la preparazione. Regolare il pH a 7,4 utilizzando NaOH. Portare il volume a 500 mL utilizzando H2O doppio distillato, quindi aliquota e conservare a -20 °C.NOTA: Questo tampone mantiene il pH e l’equilibrio osmotico nel tampone di digestione e fornisce alle cellule acqua e ioni inorganici essenziali. Contiene magnesio, così come glucosio come fonte di energia. Il potassio nella soluzione fornisce effetti protettivi sull’attività elettromeccanica nella soluzione cellulare isolata. I sali in polvere sono igroscopici e devono essere protetti dall’umidità. L’intero contenuto della miscela deve essere utilizzato immediatamente dopo la preparazione. La preparazione di una soluzione salina concentrata non è raccomandata in quanto possono formarsi precipitati. La sterilizzazione mediante filtrazione (filtro da 0,22 μm) può essere eseguita se le cellule devono essere coltivate dopo l’analisi. Preparare la soluzione enzimatica di digestione in un tubo conico da 15 ml aggiungendo volumi e quantità raccomandati per ciascun componente(tabella 2). Aggiungere la soluzione di tirodo di sodio fino a 2,5 mL. Vortice completamente da sciogliere.NOTA: La papaina è una proteasi sulfhydryl dal lattice di Carica papaya. La papaina ha un’ampia specificità e degrada la maggior parte dei substratiproteici 9. La papaina si è dimostrata meno dannosa e più efficace di altre proteasi nei protocolli di dissociazione cellulare10. Nella tabella 2 forniamo dettagli sui quattro protocolli di dissociazione; abbiamo osservato il protocollo sezione 3 per supportare la massima vitalità (93%) delle sospensioni cellulari preparate dalla vescica del topo. Procedura di dissociazione e preparazione della sospensione cellulare Raccogliere la vescica dai topi dopo la perfusione. Forare la vescica per rilasciare il contenuto, se del caso. Aggiungere 100 μL della soluzione di Tyrode a un tubo di centrifuga e tara vuoti da 1,5 ml. Posizionare la vescica nel tubo e pesare di nuovo per determinare un peso preciso della vescica. Posizionare la vescica su una piastra di Petri di 10 cm sul ghiaccio e aggiungere 100 μL della soluzione di Tiroide per la tritatura. Utilizzando forbici chirurgiche, tagliare i pezzi il più piccolo possibile riducendo al minimo il tempo di tritatura a non più di 2\u20123 min per vescica. Se si raggruppa il tessuto vescicale da più animali, tritare le vesciche tutto in una volta. Trasferire il tessuto della vescica tritato utilizzando una punta di pipetta a foro largo in 2,5 mL di tampone di digestione per ogni vescica. Regolare il volume se più vesciche sono raggruppate. Incubare il tessuto in soluzione di digestione a 37 °C in un’incubatrice su un miscelatore di nutator per 40 minuti. Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere il tubo di digestione dall’incubatore. Soluzione di digestione triturata (pipetta su e giù) utilizzando una pipetta da 5 mL per 1 min. Centrifuga per 10 min a 350 x g a 4 °C. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di soluzione di distacco cellulare. Mettere in un incubatore a 37 °C su miscelatore nutator per 10 min. Centrifuga per 10 min a 350 x g a 4 °C. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di lysis RBC (1x). Incubare per 1 minuto. Aggiungere 9 mL PBS per diluire il buffer RBC e arrestare la llisi RBC. Passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un tubo conico da 50 ml, utilizzando lo stantuffo da una siringa per raschiare leggermente il filtro cellulare per garantire il passaggio completo della cella. Assicurarsi di raccogliere il liquido che passa attraverso il colino ma potrebbe essere catturato sul lato inferiore del colino. Centrifuga per 10 min a 350 x g a 4 °C. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 200 μL di tampone di colorazione cellulare (PBS con FBS al 2%). Conta le celle. Immunoetichettatura di cellule specifiche per la citometria a flussoNOTA: Per rilevare diversi tipi di cellule nella vescica, abbiamo progettato un pannello di citometria a flusso multicolore. Per eseguire la compensazione e ideare una strategia di gating appropriata, includiamo controlli non contaminati e a fluorescenza meno uno (FMO). I controlli FMO sono importanti per gateare la popolazione positiva, in particolare quando la frazione positiva è fioca. La procedura di colorazione è la seguente. Blocco dei recettori FcγRII/III sulle celluleNOTA: Si consiglia di bloccare il legame non specifico degli anticorpi monoclonali mediante pre-incubazione di cellule con anticorpi recettori monoclonali anti-Fc, o proteina Fc ricombinante. Lavare le cellule per centrifugazione a 350 x g per 5 min a 4 °C e aggiungere il tampone di colorazione cellulare. Scartare i recettori FcγRII/III supernatanti e bloccare sulle cellule per prevenire la colorazione di anticorpi non specifici aggiungendo anticorpi CD16 e CD32 nel tampone di colorazione cellulare a diluizione di 1:100. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti.NOTA: Non è necessario lavare le cellule; le celle possono essere macchiate direttamente dopo questa fase. Colorazione per FMONOTA: Un controllo Fluorescence Minus One (FMO) è un tubo di tutti i fluorocromi utilizzati nell’esperimento che contiene tutti i fluorocromi tranne uno. Ad esempio, se si dispone di 4 fluorocromi diversi (A, B C e D + Annexin V e propidio ioduro (PI)), preparare i tubi FMO come segue. FMO Tube 1: Anticorpi coniugati con fluorocromi B, C, D + (Annexin V e PI); FMO Tube 2: Anticorpi coniugati con fluorocromi A, C, D + (Annexin V e PI); FMO Tube 3: Anticorpi coniugati con fluorocromi A, B, C + (Annexin V e PI); FMO Tube 4: Anticorpi coniugati con fluorocromi A, B, C, D + (Annexin V); FMO Tube 5: Anticorpi coniugati con A, B, C, D fluorocromi + (PI). Si consideri la natura del fluorocromo coniugato per l’anticorpo Annexin V. Colorazione delle cellule bloccate con gli anticorpi desiderati Incubare le cellule bloccate con apposito mix master di anticorpi coniugati con fluoroforo contro le proteine desiderate per 20 minuti su ghiaccio protetto dalla luce. Ricorda di includere le FMO. Lavare le celle con 1 ml di tampone di colorazione cellulare aggiunto a ciascun tubo e quindi centrifugare nuovamente a 350 x g per 5 minuti a 10 °C. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 200 μL di tampone di colorazione cellulare. Conservare sul ghiaccio fino a quando i dati di fluorescenza non possono essere acquisiti utilizzando un citometro a flusso. Applicare la macchia Annexin V/ PI. Preparare una soluzione funzionante di PI (100 μg/mL) in 1x tampone legante annexin come descritto nel protocollo del fabbricante per il kit di apoptosi a celle morte. Determinare la densità delle celle e annotare il buffer e il volume in cui sono memorizzate. I campioni di centrifuga a 350 x g per 5 minuti, scartano le cellule supernatanti e resuspend in 1x tampone legante l’annesso ad una densità di ~1 x10 6 celle/mL in un volume di 100 μL. Aggiungere fitc-annexin V (5 μL) e pi soluzione di lavoro (1 μL) a ciascun campione (100 μL), come descritto nel protocollo del produttore, e incubare a temperatura ambiente per 15 min. Aggiungere 400 μL di 1 tampone legante l’annesso ai campioni, mescolare per inversione e tenere sul ghiaccio fino alla citometria del flusso. Calibrazione FACS Citometria del flusso e controllo della purezza Inizia l’analisi della citometria a flusso misurando le cellule non contaminate per delineare la morfologia cellulare e i trogoli dei fluorocromi. Regolare la dispersione laterale (SSC) e la dispersione in avanti (FSC) modificando le tensioni di ogni parametro di fluorescenza. Misurare l’emissione di fluorescenza a 530 nm (allegato V) e >575 nm (PI). Definire la popolazione negativa nel primo decennio utilizzando le griglie su ogni tracciato di punti. Posizionare ogni controllo FMO nel citometro e correggere la sovrapposizione spettrale fino a quando le mediane di popolazione negative e positive non sono allineate. Misura 100.000 eventi. Misurare le celle macchiate con marcatori specifici e creare cancelli per le popolazioni cellulari di interesse. Analisi dei dati Raccogliere i dati dal citometro di flusso. Aprire il software per visualizzare l’area di lavoro per l’analisi. Creazione di un’area di lavoro Importare file FCS trascinandoli nell’area di lavoro. I file saranno visibili nella sezione di esempio e gruppo dell’area di lavoro. Fare doppio clic nel nome di esempio per aprire il file. Utilizzare l’area di dispersione laterale (SSC-A) per l’asse y e l’area di dispersione in avanti (FSC-A) per l’asse x (Figura 3A). Fare clic sull’icona per la gating poligonale. Creare un gate attorno alla popolazione di celle di interesse nel grafico a punti facendo clic per creare un nodo gate e quindi continuare a fare clic intorno alla popolazione di celle fino al completamento; fare doppio clic per chiudere il cancello. Assegnare al gate il nome in base alla popolazione acquisita (ad esempio, “Tutte le celle”) e fare clic su OK.NOTA: facendo doppio clic all’interno del gate “Tutte le celle” si aprirà una nuova finestra del grafico che mostra solo gli eventi contenuti in “Tutte le celle”. Regolate l’asse y del nuovo plottaggio punti su SSC-H (altezza di dispersione laterale) facendo clic sulla freccia nera e selezionate di modificare l’asse y.NOTA: questo è un gate per celle singole (singolette) ed esclude doppietti o aggregati più grandi (Figura 3B). Poiché le singole celle hanno larghezza e lunghezza proporzionali, dovrebbero essere rappresentate come una popolazione sulla diagonale. Le cellule che cadono al di fuori di questo cancello diagonale sono doppietti o aggregati più grandi. Fare doppio clic sul cancello per analizzare le cellule necrotiche (PI-positive), apoptotiche precoci (Annexin V-positive, PI-negative) e tardo apoptotiche (Annexin V-positive, PI-negative)(Figura 3C). Etichettare l’asse x come allegato V e l’asse y come PI.NOTA: In alcuni casi, dove l’intensità del segnale è bassa, le popolazioni cellulari possono sembrare avere valori di fluorescenza negativi, come risultato della correzione per lo sfondo. In questo caso, si consiglia di eseguire una trasformazione bi-esponenziale. A tale fine, fare clic sulla T accanto all’asse y e scegliere Personalizza asse. Nella nuova finestra modificare la scala in bie esponenziale (Biex), aggiungere valori negativi agli assi aumentando la base di larghezza e fare clic su Applica. Ciò migliorerà la risoluzione degli eventi con bassa intensità del segnale. Mostra i dati come plottaggio di conteggio. Utilizzate la scheda Opzione (Option) appena sotto l’asse x e selezionate tracciato contatore (Counter Plot) dal menu. Disegna un cancello Quat sulla trama per definire 4 popolazioni bersaglio discrete. Fare clic nella parte superiore della finestra per aprire l’editor di layout, facendo clic in Editor layout e trascinando le popolazioni in ogni area separata. Inserire i tracciati nell’editor di layout trascinando e rilasciando le popolazioni dall’area di lavoro nella finestra dell’editor di layout. Visualizzazione con istogrammi Scegliere istogramma dalla scheda Opzioni. Applicare un cancello per selezionare l’allegato nelle celle V-positive; in alternativa, le popolazioni positive e negative possono essere definite utilizzando lo strumento bisettoriale. La sezione di esempio deve ora mostrare le diverse popolazioni che sono state formate e la loro gerarchia. Per confrontare i campioni, trascinare tutti gli istogrammi uno sopra l’altro; Fare clic con il pulsante destro del mouse sull’istogramma e dall’istogramma scegliere Offset sfalsato. Aggiungere analisi statistiche Aprire la scheda Statistica facendo doppio clic sulla popolazione di interesse. Selezionare la funzione da applicare e il parametro coinvolto. Ripeti con altre popolazioni, trascinando l’icona Sigma nel nome della popolazione. Applicare l’analisi a tutti i campioni selezionando la strategia di gating dal campione di interesse e trascinandolo nel gruppo definito dal marcatore di interesse, ad esempio l’allegato V. Creare gate nei campioni di controllo FMO e definire popolazioni negative e positive; questa strategia di gating verrà applicata all’intero esperimento (Figura 3D\u2012F).NOTA: Controllare ogni campione singolarmente per assicurarsi che la gating sia corretta e modificarla ove necessario. Se le cellule sono state macchiate con anticorpi marcatori (ad esempio CD45) utilizzare di conseguenza l’FMO e il gate corrispondenti. Per esportare il layout, fare clic su File | Esporta immagine | Selezionare il formato di file (ad esempio, jpg, pdf). Fare clic su Crea tabella per aprire una finestra con la versione finale della tabella. Esportare la tabella selezionando File | Salva con nome | Nomefile.