Summary

Nöral Progenitörlerin ve Nöronların Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

Fare embriyonik kök hücrelerinin asma damlası yöntemini kullanarak nöronal hücrelere in vitro farklılaşması prosedürünü açıklıyoruz. Ayrıca RT-qPCR, immünofluoresans, RNA-seq ve akış sitometrisi ile kapsamlı bir fenotipik analiz gerçekleştiriyoruz.

Abstract

Fare embriyonik kök hücrelerinin nöronal soylara kült haline alınması ve ayırt edilmesi için adım adım prosedürü ve ardından farklılaştırılmış hücreleri karakterize etmek için bir dizi tahlil açıklıyoruz. E14 fare embriyonik kök hücreleri, asılı bırakma yöntemiyle embriyoid cisimleri oluşturmak için kullanıldı ve daha sonra retinoik asit ile nöral progenitör hücrelere farklılaşmaya teşvik edildi ve son olarak nöronlara farklılaştı. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofluoresans deneyleri, nöral progenitörlerin ve nöronların sırasıyla 8 ve 12. Sox1 promotör güdümlü bir GFP muhabirini ifade eden bir E14 hattında yapılan akış sitometrisi deneyleri, 8. günde hücrelerin yaklaşık% 60’ının GFP pozitif olduğunu ve bu aşamada nöral progenitör hücrelerin başarılı farklılığını gösterdiğini göstermiştir. Son olarak, küresel transkriptomik değişikliklerin profilini çıkarmak için RNA-seq analizi kullanılmıştır. Bu yöntemler, nöronal farklılaşma sırasında hücre kimliği geçişini düzenlemede belirli genlerin ve yolların katılımını analiz etmek için yararlıdır.

Introduction

Gelişmekte olan fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden ilk türetmelerinden bu yana1,2, fare embriyonik kök hücreleri (mESC) kök hücre kendini yenileme ve farklılaşmayı incelemek için güçlü araçlar olarak kullanılmıştır3. Ayrıca, mESC farklılaşması, nörodejeneratif bozukluklar gibi hastalıkların tedavisinde kök hücre bazlı tedavide verimliliği ve güvenliği artırabilecek moleküler mekanizmaların muazzam bir şekilde anlaşılmasına yol açar4. Hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, bu in vitro sistem pratik ve değerlendirmede basitlik, hayvanların aksine hücre hatlarının bakımında düşük maliyet ve genetik manipülasyonlarda göreceli kolaylık gibi birçok avantaj sağlar. Bununla birlikte, farklılaştırılmış hücre türlerinin verimliliği ve kalitesi genellikle farklı mESC çizgilerinin yanı sıra farklılaşma yöntemlerinden etkilenir5,6. Ayrıca, farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için geleneksel tahliller, sağlamlıktan yoksun olan seçilmiş marker genlerinin nitel incelemesine dayanır ve bu nedenle gen ifadesindeki küresel değişiklikleri kavrayamazlar.

Burada nöronal farklılaşmanın sistematik olarak değerlendirilmesi için bir dizi tahlil kullanmayı hedefliyoruz. Seçilen belirteçlerde hem geleneksel in vitro analizleri hem de RNA-seq kullanarak, bu süreçteki transkriptomik değişikliklerin yanı sıra farklılaşma verimliliğinin ölçümü için bir platform oluşturuyoruz. Daha önce belirlenmiş bir protokol7‘ye dayanarak, asma damla tekniği ile embriyoid cisimleri (EBs) oluşturduk, ardından daha sonra nöral indüksiyon ortamına sahip nöronlara farklılaştırılmış olan nöral progenitör hücreler (NPC’ ler) oluşturmak için suprafizyolojik retinoik asit (RA) kullanarak indüksiyon oluşturduk. Farklılaşmanın verimliliğini incelemek için, geleneksel RT-qPCR ve immünofluoresans (IF) testlerine ek olarak, RNA-seq ve akış sitometrisi gerçekleştirdik. Bu analizler, aşamaya özgü farklılaşmanın ilerlemesinin kapsamlı bir ölçümünü sağlar.

Protocol

1. mESC kültürü 10 cm doku kültürü ile işlenmiş bir plakayı% 0.1 jelatin ile kaplayın ve jelatin aspire etmeden önce en az 15-30 dakika ayarlanın. Önceden ısıtılmış mESC ortamında (Dulbecco’nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler ile mESC’leri kültlemeden bir gün önce tohum γ ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları (MEF’ler), β-mercaptoethanol, L-glutamin, penisilin/streptomisin, sodyum piruvat, LIF, PD0325901 …

Representative Results

Yöntemimizin bir temsili olarak, E14 hücreleri üzerinde EB, NPC ve nöron farklılaşma deneyi gerçekleştirdik. E14 hücreleri, γ ışınlanmış MEF popülasyonu seyreltilene kadar γ ışınlanmış MEF’lerde kültürlenmiştir (Şekil 1A). Nanog ve Oct4 belirteçleri için Alkalin Fosfataz (AP) boyama ( Şekil 1B ) ve daha sonra RT-qPCR (aşağıya bakın) gerçekleştirerekE14hücrelerinin pluripotency’liğini doğruladık. γ ışın…

Discussion

Fare embriyonik kök hücrelerinin sinirsel farklılaşması için yöntem onlarca yıldır oluşturulmuştur ve araştırmacılar önceki protokolleri değiştirmeye veya çeşitli amaçlar için yenilerini oluşturmaya devam etmişlerdir7,10,11. MESC’lerin nöronlara farklılaşma aşamalarının verimliliğini ve ilerlemesini kapsamlı bir şekilde analiz etmek için bir dizi tahlil kullandık, bu da fare veya insan ESC’lerin…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH’den (1R35GM133496-01) Z. Gao’ya verilen bir hibe ile desteklendi. Bölümlemedeki yardımları için Dr. Ryan Hobbs’a teşekkür ederiz. Penn State College of Medicine’ın Genom Bilimleri ve Biyoinformatik, İleri Işık MikroskopiSi Görüntüleme ve Akış Sitometrisi gibi temel tesislerine teşekkür ediyoruz. Ayrıca RNA-seq analizindeki yardımları için Dr. Yuka Imamura’ya teşekkür ederiz.

Materials

0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X Corning 25-052-CV
0.1% Gelatin Sigma G1890-100G Prepared in de-ionized water
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28908 Diluted in 1X PBS
40-μm cell strainer Falcon 352340
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11001 Antibody was diluted at 1:500 for IF
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox Azura Genomics AZ-2105
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSCanto BD 657338
bFGF Sigma 11123149001
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Chir99021 Cayman Chemicals 13122
Chloroform C298-500 Fisher Chemical
DAPI Invitrogen R37606
DMEM Corning 10-017-CM
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320033
EB buffer Qiagen 19086
Ethanol 111000200 Pharmco Diluted in de-ionized water
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals S10250
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
Isopropanol BDH1133-4LG BDH VWR Analytical Diluted in de-ionized water
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030024
LIF N/A N/A Collected from MEF supernatant
m18srRNA primers IDTDNA N/A 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3'
5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'
MEM Non-essential amino acids Corning 25-025-Cl
mNanog primers IDTDNA N/A 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3'
5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'
mNes primers IDTDNA N/A 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3'
5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'
mNeuroD1 primers IDTDNA N/A 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3'
5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'
mOct4 primers IDTDNA N/A 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3'
5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'
mPax6 primers IDTDNA N/A 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3'
5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'
N2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin primary antibody Millipore MAB5326 Antibody was diluted at 1:200 for IF
Neural basal Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament primary antibody DSHB 2H3
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit BioO Scientific NOVA-5138-07
PD0325901 Cayman Chemicals 13034
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Phosphate-buffered saline (PBS) N/A N/A Prepared in de-ionized water
– Potassium chloride P217-500G VWR
– Potassium phosphate monobasic anhydrous 0781-500G VWR
– Sodium chloride BP358-10 Fisher Bioreagents
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate SX0715-1 Milipore
Random hexamer primer Thermo Scientific SO142
Retinoic acid Sigma R2625 Prepared in DMSO
Sodium pyruvate Corning 25-000-Cl
Sucrose Sigma 84097 Diluted in 1X PBS
SuperScript III Reverse Transcriptase Invitrogen 18064022
Tissue-Tek O.C.T. compound Sakura 4583
TriPure Isolation Reagent Sigma-Aldrich 11667165001
TruSeq Rapid Illumina 20020616
β-mercaptoethanol Fisher BioReagents BP176-100

Referências

  1. Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
  3. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  4. Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
  5. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  6. McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
  7. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  8. Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
  9. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
  10. Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
  11. Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
  12. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
  13. Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  14. Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
  15. Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
  16. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
  17. Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  18. Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  19. Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
  20. Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
  21. Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
  22. Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
  23. Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
  24. Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
  25. Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
  26. Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
  27. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  28. Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Hanafiah, A., Geng, Z., Wang, Q., Gao, Z. Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (159), e61446, doi:10.3791/61446 (2020).

View Video