Summary

독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

Published: August 08, 2020
doi:

Summary

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부입니다. 병아리 CG 뉴런의 신경 배양신경 근육 상호 작용의 연구에서 효과적인 세포 모델 것으로 나타났다. 우리는 병아리 배아에서 CG 뉴런의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

병아리 섬모 신경질 (CG)는 부교감 신경계의 일부이며 눈에 존재하는 근육 조직의 내면화를 담당합니다. 이 신경절은 섬모와 코로이드 뉴런의 균일 한 인구에 의해 구성되며, 내면의 무늬와 부드러운 근육 섬유는 각각. 이러한 신경 유형의 각각특정 눈 구조 와 기능을 조절. 수년에 걸쳐, 병아리 섬모 신경질의 신경 배양은 해막 시냅스를 통해 통신하는 근육 신경계 상호 작용의 연구 결과에 있는 효과적인 세포 모형으로 보였습니다. Ciliary 신경절 뉴런은, 그것의 대다수에서, 콜린성. 이러한 세포 모델은 이전에 사용되는 이질세포 모델들이 여러 신경세포를 포함하는 비교적 유용하게 사용되어 왔으며, 그 외에 는 콜린성 이외에. 해부학적으로, 섬모 신경절은 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이에 국한된다. 여기에서, 우리는 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해피 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 CG 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공하여 프로세스의 주요 단계를 강조합니다. 이러한 문화는 15일 동안 체외에서 유지될 수 있으며, 이를 통해 CG 문화의 정상적인 발전을 보여줍니다. 결과는 또한 이 뉴런이 신경 근육 질의 시냅스를 통해 근육 섬유와 상호 작용할 수 있음을 보여줍니다.

Introduction

Ciliary 신경절 (CG) 뉴런은 부교감 신경계에 속한다. 이러한 뉴런은 해골성이며, 무스카린 또는 니코틴 시냅스1,,2,,3을설정할 수 있다. 해부학적으로, CG는 시신경(ON)과 코로이드 균열(CF) 사이의 눈의 후방 부분에 위치하며 초기 배아 단계1,,4에서약 6000뉴런으로 구성된다. 문화의 첫 주에 대 한, 섬 모 성 신경 절개 뉴런은 다극성 형태를 제시. 일주일 후, 그들은 축 하5확장 하 고 형성 하는 하나의 neurite와 함께 단극성 상태로 전환 하기 시작. 또한, CG 뉴런의 약 절반은 병아리 배아 발달의8일과 14일 사이에 세포 사멸의 프로그램된 과정을 통해 죽는다. 이 뉴런의 수의 감소는 약 3000 뉴런66, 7,7,8의섬모 신경절의 총 인구 결과. 시험관에서는, 근육세포9와 CG 뉴런으로 성장하면 CG 뉴런의 수가 감소하지않으며,CG 뉴런은 몇 주 동안 배양될 수 있다1,9.

섬광 신경절은 모분 뉴런과 치오로이드 뉴런의 균일 한 인구로 구성되어 있으며, 각각 CG에서 신경 인구의 절반을 나타내며 눈의 근육을 내면화합니다. 뉴런의 이 두 가지 유형은 구조적으로, 해부학적으로 기능적으로 구별됩니다. Ciliary 뉴런은 홍채와 렌즈에 줄무늬 근육 섬유를 내면으로 고정하여 동공 수축을 담당합니다. 코로이드 뉴런은 코로이드1,10,,,11,,12의부드러운 근육을 내면으로 한다.

닭 섬모 신경절 신경절 뉴런의 배양신경신경은 신경 근육 시냅스와 시냅스 형성1,,5,,9의연구에 유용한 도구로 표시되었습니다. 신경근육 시냅스가13이며,해조류인 신경인구를 사용하여 CG 뉴런이 이전 세포모델(14)에대한 잠재적 대안으로 떠올랐다. 이 모형은 단지 작은 부분이 해병인 이종성 신경 인구에서 이루어져 있습니다. 대안적으로, 섬모 신경절 뉴런은 시험관 내에서 상대적으로 빠르게발전하고, 약 15시간 후에 이미 시냅스1을형성한다. CG 뉴런은 분리와 조작의 상대적으로 용이성 으로 인해, 독특한 연구 연구를 위한 수년에 걸쳐 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 이러한 응용 분야는 광유전학 연구, 시냅스 개발, 세포사멸 및 신경 근육 상호 작용14,,15를포함한다.

우리는 배아 일 7 (E7) 병아리 배아에서 섬모 신경신경의 해부, 해리 및 체외 문화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 우리는 콜린성 뉴런의 매우 순수하고 안정적인 세포 배양을 얻기 위해 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 특별한 주의를 필요로하고 신경 문화의 질을 향상시킬 프로토콜의 주요 단계를 강조. 이러한 문화권은 적어도 15일 동안 시험관내에서 유지될 수 있다.

Protocol

1. 시약 준비 참고 : 이 절차에 필요한 재료는 다음과 같습니다 : 집게 (nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 해부 페트리 접시 (검은 바닥), 24 웰 플레이트, 플라스틱 파스퇴르 파이펫, 화재 광택 유리 파스퇴르 파이펫, 10 mL 주사기, 0.22 μm 주사기 필터. 유리 커버립, 집게(nº 5 및 nº 55), 수술 핀셋, 페트리 접시(검은 바닥), 증류된 H2O, 파이펫 및 수술용 소재를 ?…

Representative Results

이 절차에 대한 예상 기간은 각 특정 실험에 필요한 수율에 따라 밀접하게 달라지므로 격리해야 하는 섬모 간질 수에 따라 달라집니다. 추정 수율 1 x 106 세포/mL의 추정 수율을 위해 약 70개의 섬모 간질(35개의 계란)을 분리합니다. 이 수의 회랑의 경우 해부 절차에 2-3 시간, 총 절차에 대해 총 4-5 시간이 소요됩니다. 격리 프로토콜의 단계별 그림은 도 1A에표시됩니다. …

Discussion

이 프로토콜에서 CG 뉴런을 준비하고 배양하는 방법을 시연했습니다. 섬모 신경절의 식별 및 해부는 경험이없는 사용자에게 어려울 수 있습니다. 따라서, 우리는 E7 병아리 섬모 신경통을 효율적으로 해부하고, 조직을 해리하고, 적어도 15 일 동안 유지 될 수있는 신경 배양을 준비하는 상세하고 단계별 절차를 제시한다. 이 프로토콜로 얻은 섬모 신경절 뉴런은 근육 세포와의 공동 배양에도 적합합…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 센트로 2020 지역 운영 프로그램을 통해 유럽 지역 개발 기금(ERDF)에 의해 조달되었으며, CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BRAINHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-0145-FEDER-000003:pAGE CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, 그리고 경쟁 및 국제화 및 FCT를 통한 포르투갈 국가 기금 운영 프로그램 – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., 프로젝트 UIDB/04539/2020, 프로젝트 UIDB/04539/2020 UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, 개인 보조금 SFRH/BD/141092/20 118 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009(R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011(J.R.P.) 및 마리 퀴리 액션 – IRG, 7번째 프레임워크 프로그램

Materials

5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

Referências

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Citar este artigo
Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

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