Användning av primär kultiverade hippocampala nervceller för att studera monteringen av Axon initiala segment
Summary
Här beskrev vi ett protokoll för att kvantitativt studera montering och struktur av axon initiala segment (AIS) av hippocampal nervceller som saknar förmonterade AIS på grund av avsaknaden av en jätte ankyrin-G.
Abstract
Neuronal axon initiala segment (AIS) är platser för inledande av åtgärder potentialer och har studerats utförligt för deras molekylära struktur, montering och aktivitet-beroende plasticitet. Giant ankyrin-G, huvudarrangören av AIS, associerar direkt med membranspäckad spänning gated natrium (VSVG) och kaliumkanaler (KCNQ2/3), samt 186 kDa neurofascin, en L1CAM cell vidhäftningsmolekyl. Giant ankyrin-G binder också till och rekryterar cytoplasmiska AIS-molekyler inklusive beta-4-spektrin och mikrotubulebindande proteiner, EB1/EB3 och Ndel1. Jätte ankyrin-G är tillräckligt för att rädda AIS-formationen i ankyrin-G bristfälliga nervceller. Ankyrin-G innehåller också en mindre 190 kDa isoform belägen vid dendritiska ryggraden istället för AIS, som inte kan rikta sig till AIS eller rädda AIS i ankyrin-G-bristfälliga nervceller. Här beskrev vi ett protokoll med odlade hippocampal nervceller från ANK3-E22/23-flox möss, som, när transfected med Cre-BFP uppvisar förlust av all isoform av ankyrin-G och försämra bildandet av AIS. Tillsammans ett modifierat Banker glia/neuron co-culture system utvecklade vi en metod för att transfect ankyrin-G null nervceller med en 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, vilket är tillräckligt för att rädda bildandet av AIS. Vi använder vidare en kvantifieringsmetod, utvecklad av Salzer och kollegor för att hantera variationer i AIS avstånd från de neuronala cellkroppar som förekommer i hippocampala neuronkulturer. Detta protokoll tillåter kvantitativa studier av de novo montering och dynamiskt beteende av AIS.
Introduction
Axon initiala segmentet ligger vid proximala axon i de flesta ryggradsdjur nervceller. Funktionellt är AIS där åtgärdspotentialer initieras på grund av hög densitet av spännings-gated natriumkanaler i denna region. AIS av vissa excitatoriska nervceller är också riktade av hämmande interneuroner genom att bilda GABAergic synapser1,2,3. Därför är AIS en kritisk plats för att integrera cellsignalering och modulera nervcellers excitabilitet. AIS är normalt 20-60 μm lång och ligger inom 20 μm från cellkroppen. Längden och positionen för AIS varierar i nervceller över hjärnregioner, liksom i olika utvecklingsstadier av samma neuron4,5. Ackumulerade bevis föreslog att sammansättningen och positionen av AIS är dynamiska för att svara på förändringen av neuronal aktivitet4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G är mästararrangör av AIS. 480 kDa ankyrin-G är ett membran associerat adapterprotein som direkt binder till spänningsgrindade natriumkanaler samt andra stora AIS-proteiner inklusive beta4-spektrin, KCNQ2/3-kanaler som modulerar natriumkanalaktivitet8,9och 186 kDa neurofascin, en L1CAM som leder GABAergic synapser till AIS2,10. 480 kDa ankyrin-G delar kanoniska ankyrindomäner som finns i de korta 190 kDa ankyrin-G-isoformen (ANK upprepar, spektrinbindningsdomän, regulatorisk domän), men utmärks av en jätte exon som endast finns i ryggradsdjur och uttrycks specifikt i nervceller (Figur 1A)11,12. Den 480 kDa ankyrin-G neuron specifika domänen (NSD) krävs för AIS-formation12. 190 kDa ankyrin-G främjar inte AIS montering eller mål AIS i ankyrin-G-null nervceller12. 190 kDa ankyrin-G är dock koncentrerat till AIS som innehåller 480 kDa ankyrin-G12. Denna förmåga hos 190 kDa ankyrin-G att rikta in sig på förmonterade AIS av wildtype nervceller har varit en källa till förvirring i litteraturen och har bromsat uppskattningen av de kritiska specialiserade funktionerna i 480 kDa ankyrin-G i AIS montering. Därför är det viktigt att studera AIS montering i ankyrin-G-null nervceller som saknar en förmonterad AIS.
Här presenterar vi en metod för att studera AIS montering och struktur med hjälp av odlade hippocampal neuroner från ANK3-E22/23-flox möss som eliminerar alla isoformer av ankyrin-G13 (Figur 1B). Genom att transfectera nervceller med en Cre-BFP-konstruktion innan AIS monteras genererade vi ankyrin-G-bristfälliga nervceller som helt saknade en AIS (Figur 1B, Figur 2). Monteringen av AIS är helt räddad efter samtransfection av 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid med en Cre-BFP plasmid. Den här metoden är ett sätt att studera AIS-sammansättningen i en icke-förmonterad AIS-miljö. Vi modifierade också glia-neuron co-culture system från Gary Banker utan att använda antibiotika, tidigare utformad för embryonala dag 18 nervceller, för tillämpning på postnatala mus nervcellerochanpassade en AIS kvantifieringsmetod för att genomsnittliga AIS mätningar från flera nervceller att normalisera variationen av AIS14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monteringen av AIS organiseras av 480 kDa ankyrin-G. Ankyrin-G har dock kortare isoformer som kan rikta sig till AIS av vilda nervceller, vilket kan leda till svårigheter att tolka struktur-funktion analyser av AIS montering. Här presenterar vi en metod med hjälp av nervceller från ANK3-E22/23-flox möss som möjliggör studier av de novo montering av AIS. Genom att transfectera med Cre-BFP vid 3 div eliminerar vi alla endogena isoformer av ankyrin-G. Vi kan också samtransfektera 480 kDa ankyrin-G …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar dr Gary Banker för förslaget om neuronal kulturprotokoll. Detta arbete stöds av Howard Hughes Medical Institute, ett anslag från NIH, och en George Barth Geller utrustad professur (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
Referências
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
