축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용
Summary
여기서, 우리는 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트(AIS)의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 프로토콜을 기술하였다.
Abstract
신경 축 축 하 초기 세그먼트 (AIS) 행동 잠재력의 개시의 사이트 이며 광범위 하 게 그들의 분자 구조대 한 연구 되었습니다., 조립 및 활동 의존가성 가소성. AIS의 마스터 오거나이저인 거대 앙키린-G는 멤브레인 스패닝 전압 게이트 나트륨(VSVG) 및 칼륨 채널(KCNQ2/3)과 L1CAM 세포 접착 분자인 186 kDa neurofascin과 직접 연결됩니다. 거대한 ankyrin-G는 또한 베타-4-spectrin및 microtubule 결합 단백질, EB1/EB3 및 Ndel1을 포함하여 세포질 AIS 분자를 결합하고 모집합니다. 거대한 ankyrin-G는 ankyrin-G 결핍 뉴런에서 AIS 형성을 구출하기에 충분합니다. Ankyrin-G는 또한 AIS를 대상으로 하거나 ankyrin-G-결핍 뉴런에서 AIS를 구출할 수 없는 AIS 대신 수지상 척추에 위치한 작은 190 kDa 이소형을 포함합니다. 여기서, 우리는 ANK3-E22/23-flox마우스에서 배양 해마 뉴런을 사용하여 프로토콜을 설명했는데, 이는 Cre-BFP로 감염될 때 안키린-G의 모든 동위체의 손실을 나타내고 AIS의 형성을 손상시킵니다. 수정된 뱅커 글리아/뉴런 공동 배양 시스템을 결합하여, AIS의 형성을 구출하기에 충분한 480kDa ankyrin-GFP 플라스미드로 안키린-G널 뉴런을 횡단하는 방법을 개발했습니다. 우리는 또한 해마 뉴런 배양에서 발생하는 신경 세포 체로부터AIS 거리의 변화를 처리하기 위해 Salzer와 동료에 의해 개발 된 정량화 방법을 사용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 de novo 어셈블리의 정량적 연구와 AIS의 동적 동작을 허용합니다.
Introduction
축 사 초기 세그먼트는 대부분의 척추 동물 뉴런에서 근위 축 축 에 위치. 기능적으로 AIS는 이 지역의 전압 게이트 나트륨 채널의 고밀도로 인해 작업 전위가 시작되는 곳입니다. 일부 흥분 성 뉴런의 AIS는 또한 GABAergic 시냅스1,2,3형성을통해 억제 인터뉴런에 의해 표적화된다. 따라서 AIS는 세포 신호를 통합하고 뉴런의 흥분성을 조절하는 중요한 사이트입니다. AIS는 일반적으로 길이가 20-60 μm이며 세포 체체의 20 μm 내에 있습니다. AIS의 길이와 위치는 뇌 영역을 통해 뉴런뿐만 아니라 동일한 뉴런4,5의다른 발달 단계에서 다릅니다. 축적된 증거는 AIS의 조성및 위치가 뉴런 활동의 변화에 반응하는데 역동적인 것으로 나타났다4,5,6,7.
480 kDa ankyrin-G는 AIS의 마스터 오거나이저입니다. 480 kDa ankyrin-G는 전압 게이트 나트륨 채널뿐만 아니라 베타4-스펙트린, KCNQ2/3 채널을 포함한 다른 주요 AIS 단백질에 직접 결합하는 멤브레인 관련 어댑터 단백질로 나트륨 채널 활성8,9,및 186 kDa neurofascin, GABAergicssic을 직접 하는 L1CAM입니다. 480 kDa ankyrin-G는 짧은 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK 반복, 스펙트럼 결합 도메인, 규제 도메인)에서 발견되는 표준 앙키린 도메인을 공유하지만 척추 동물에서만 발견되며 뉴런(그림 1A)11,12에서구체적으로 표현되는 거대한 엑소로 구별됩니다. 480 kDa ankyrin-G 뉴런 특이 도메인(NSD)은 AIS형성(12)에필요하다. 190 kDa ankyrin-G는 ankyrin-G-null뉴런(12)에서AIS 어셈블리 또는 타겟 AIS를 촉진하지 않는다. 그러나, 190 kDa ankyrin-G는 480 kDa ankyrin-G12를포함하는 AIS에 집중된다. 190kDa ankyrin-G의 이러한 능력은 야생형 뉴런의 사전 조립된 AIS를 표적으로 하는 것이 문헌의 혼란의 원천이었으며 AIS 어셈블리에서 480kDa ankyrin-G의 중요한 전문 기능에 대한 인식을 늦추고 있다. 따라서 사전 조립된 AIS가 부족한 안키린-G-null 뉴런에서 AIS 어셈블리를 연구하는 것이 중요합니다.
여기서, 안키린-G13(도 1B)의모든 등색을 제거하는 ANK3-E22/23-flox 마우스로부터 배양된 해마 뉴런을 사용하여 AIS의 조립 및 구조를 연구하는 방법을 제시한다. AIS가 조립되기 전에 Cre-BFP 구조로 뉴런을 변형시킴으로써, 우리는 완전히 AIS(도 1B, 도 2)가부족한 ankyrin-G-결핍 뉴런을 생성했습니다. AIS의 조립은 Cre-BFP 플라스미드와 480 kDa ankyrin-G-GFP 플라스미드의 공동 변환에 따라 완전히 구출된다. 이 방법은 사전 조립되지 않은 AIS 환경에서 AIS 어셈블리를 연구하는 방법을 제공합니다. 또한 이전에 배아일 18뉴런을 위해 설계된 항생제를 사용하지 않고 게리 뱅커로부터 글리아-뉴런 공동 배양 시스템을 수정하여 산후 마우스 뉴런에 적용하고 AIS14,15의변이를 정상화하기 위해 여러 뉴런으로부터 AIS 측정을 평균하는 AIS 수량 방법을 적용하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
AIS의 조립은 480 kDa ankyrin-G에 의해 조직된다. 그러나, ankyrin-G는 AIS 어셈블리의 구조 기능 분석의 해석에 어려움을 초래할 수 있는 야생형 뉴런의 AIS를 표적으로 할 수 있는 짧은 동소형을 갖는다. 여기서 우리는 AIS의 드 노보 조립의 연구를 허용하는 ANK3-E22/23-flox 마우스에서 뉴런을 사용하는 방법을 제시한다. 3 div에서 Cre-BFP와 변형함으로써, 우리는 ankyrin-G의 모든 내인성 동소형을 제…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 신경 배양 프로토콜에 대한 제안에 대한 박사 게리 뱅커 에게 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소에 의해 지원됩니다, NIH에서 보조금, 조지 바스 겔러는 교수를 부여 (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
Referências
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
