Использование первичных культивированных нейронов гиппокампа для изучения сборки начальных сегментов аксона
Summary
Здесь мы описали протокол количественного изучения сборки и структуры исходных сегментов аксона (AIS) нейронов гиппокампа, в которых отсутствует предварительно собранная АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G.
Abstract
Начальные сегменты аксона нейронов (АИС) являются участками инициации потенциалов действия и были широко изучены на предмет их молекулярной структуры, сборки и пластичности, зависящей от активности. Гигантский анкирин-G, главный организатор АИС, напрямую ассоциируется с мембранными напряжениями закрытого натриевого (VSVG) и калиевого каналов (KCNQ2/3), а также с нейрофасцином 186 кДа, молекулой адгезии клеток L1CAM. Гигантский анкирин-G также связывается и рекрутирует цитоплазматические молекулы АИС, включая бета-4-спектрин, и микротрубочки-связывающие белки, EB1 / EB3 и Ndel1. Гигантского анкирина-G достаточно для спасения образования АИС в нейронах с дефицитом анкирина-G. Анкирин-G также включает меньшую изоформу 190 кДа, расположенную в дендритных шипах вместо АИС, которая не способна нацеливаться на АИС или спасать АИС в нейронах с дефицитом анкирина G. Здесь мы описали протокол с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, которые при трансфекции Cre-BFP демонстрируют потерю всей изоформы анкирина-G и ухудшают образование АИС. Объединив модифицированную систему кокультуры глии и нейронов Банкира, мы разработали метод трансфектации анкирин-G нулевых нейронов с плазмидой 480 кДа анкирин-G-GFP, что достаточно для спасения образования АИС. Мы также используем метод количественной оценки, разработанный Зальцером и его коллегами для борьбы с изменением расстояния АИС от тел нейронных клеток, которое происходит в культурах нейронов гиппокампа. Этот протокол позволяет проводить количественные исследования сборки de novo и динамического поведения АИС.
Introduction
Начальный сегмент аксона расположен в проксимальном аксоне в большинстве нейронов позвоночных. Функционально АИС – это место, где инициируются потенциалы действия из-за высокой плотности натриевых каналов с напряжением в этой области. АИС некоторых возбуждающих нейронов также нацелены на тормозные интернейроны путем образования ГАМКергических синапсов1,2,3. Таким образом, АИС является критическим участком для интеграции клеточной сигнализации и модуляции возбудимости нейронов. АИС обычно составляет 20-60 мкм в длину и расположена в пределах 20 мкм от тела клетки. Длина и положение АИС варьируется в нейронах по областям мозга, а также на разных стадиях развития одного и того женейрона4,5. Накопленные данные свидетельствуют о том, что состав и положение АИС динамичны в ответ на изменение активности нейронов4,5,6,7.
480 кДа анкырин-Г является мастер-организатором АИС. 480 кДа анкирин-G представляет собой мембранно-ассоциированный адапторный белок, который непосредственно связывается с напряжением закрытых натриевых каналов, а также с другими основными белками AIS, включая бета4-спектрин, каналы KCNQ2/3, которые модулируют активность натриевых каналов8,9и 186 кДа нейрофасцина, L1CAM, который направляет ГАМКергические синапсы к AIS2,10. 480 кДа анкирин-G разделяет канонические анкириновые домены, обнаруженные в короткой 190 кДа анкирин-G изоформе (ank repeats, спектрин-связывающий домен, регуляторный домен), но отличаются гигантским экзоном, который встречается только у позвоночных и специфически экспрессируется в нейронах(рисунок 1A)11,12. Специфический домен нейронов анкирин-G (НРД) 480 кДа необходим для формирования АИС12. 190 кДа анкирин-G не способствует сборке АИС и не нацеливает АИС в анкирин-G-нулевых нейронах12. Однако 190 кДа анкирина-Г сосредоточено на АИС, содержащей 480 кДа анкирина-Г12. Эта способность 190 кДа анкирина-G нацеливаться на предварительно собранную АИС нейронов дикого типа была источником путаницы в литературе и замедлила оценку критических специализированных функций 480 кДа анкирина-G в сборке АИС. Поэтому крайне важно изучать сборку АИС в анкирин-G-нулевых нейронах, в которым отсутствует предварительно собранная АИС.
Здесь мы представляем метод изучения сборки и структуры АИС с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, который устраняет все изоформы анкирина-G13 (рисунок 1B). Трансфектируя нейроны с помощью конструкции Cre-BFP до сборки AIS, мы генерировали анкирин-G-дефицитные нейроны, полностью лишенные AIS(рисунок 1B, рисунок 2). Сборка АИС полностью спасена после совместной трансфекции плазмиды анкирин-G-GFP 480 кДа с плазмидой Cre-BFP. Этот метод обеспечивает способ изучения сборки АИС в несборной среде АИС. Мы также модифицировали систему кокультуры глиа-нейрон от Гэри Бэнкера без использования антибиотиков, ранее разработанную для эмбриональных нейронов 18-го дня, для применения к постнатальным нейронам мыши и адаптировали метод количественного определения АИС для усреднения измерений АИС от нескольких нейронов для нормализации вариации АИС14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сборка АИС организована 480 кДа анкырин-Г. Однако анкирин-G имеет более короткие изоформы, которые могут нацеливаться на АИС нейронов дикого типа, что может привести к трудностям в интерпретации структурно-функционального анализа сборки АИС. Здесь мы представляем метод с использованием …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Гэри Банкира за предложение по протоколу нейронной культуры. Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, грантом NIH и профессорским саном Джорджа Барта Геллера (V.B.).
Materials
| 10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
| 190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
| 2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| 480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
| ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
| B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
| Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |
Referências
- Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
- Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
- Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
- Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
- Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
- Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
- Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
- Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
- Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
- Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
- Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
- Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
- Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
- Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).
