Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Le système immunitaire inné comprend plusieurs types de cellules qui stimulent l’activation complète et l’inflammation. Les cellules immunitaires innées comprennent les cellules tueuses naturelles (NK), les mastocytes, les basophiles, les éosinophiles, les neutrophiles et les phagocytes mononucléaires. Les phagocytes mononucléaires, qui sont composés des monocytes, des macrophages, et des cellules dendritiques, ont été impliqués dans la pathophysiologie des conditions ophtalmiques multiples comprenant l’uvéite, la rétinopathie diabétique, et la dégénérescence maculaire relative à l’âge (AMD)¹. Dans ce protocole, nous nous concentrerons sur l’identification des phagocytes mononucléaires utilisant l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres dans un modèle de souris de AMD néovasculaire^2. Ce protocole est adaptable pour les modèles murins de rétinopathie diabétique et/ou d’uvéite, mais une dissection oculaire plus étendue est recommandée en raison de la nature systémique de ces maladies.

Les phagocytes mononucléaires expriment des marqueurs de surface cellulaire qui se chevauchent. Les macrophages et les microglies résidents de tissu de longue durée proviennent de l’ancêtre érythromyéloïde dérivé du sac^{jaune 3,}tandis que le recyclage des macrophages et des cellules dendritiques se différencient de l’ancêtre de cellules dendritiques macrophages dérivé de la^{moelle osseuse 4}. Les marqueurs de surface de cellules de souris communs aux monocytes, aux macrophages, et aux cellules dendritiques incluent CD45, CD11b^5,F4/80^6,Cx3cr1^7,et le marqueur intracellulaire Iba1^8. Afin de surmonter ce défi, l’analyse transcriptomique des macrophages, des monocytes et des cellules dendritiques de tissus multiples définit CD64 comme un marqueur de surface cellulaire spécifique au macrophage⁶. Des macrophages ont été décrits dans l’iris, le choroïde, le corps ciliaire, et le nerf optique dans les yeux sains^3. Alternativement, l’identification des cellules dendritiques est plus difficile; la méthode la plus spécifique d’identification des cellules dendritiques nécessite une cartographie du destin à l’aide de la souris reporter Zbtb46-GFP⁹. Indépendamment de cette ligne de reporter, l’expression de CD11c et MHCII en conjonction avec l’absence de CD64 peut identifier les cellules dendritiques^{potentielles 6,10}. Des cellules dendritiques ont été identifiées dans la cornée, la conjonctive, l’iris, et le choroïde dans les yeux^{normaux 11.} Les microglies sont des macrophages spécialisés situés dans la rétine, protégés par la barrière céphalo-rétinienne, et dérivés des cellules progénitrices de sac^{jaune 12.} En conséquence, les microglies rétiniennes peuvent être différenciées des macrophages monocyte-dérivés par leurs niveaux faibles de l’expression de CD45¹³ et des niveaux élevés de Tmem119, qui est disponible comme anticorps de cytométrie de flux^14. Lors de l’activation des microglies, cependant, CD45 peut être jusqu’à réglementé¹⁵ et Tmem119 peut être^{sous-réglementé 3}, démontrant la complexité de la biologie des microglies et cela est probablement pertinent à la fois dans AMD et son modèle de souris. Enfin, les monocytes peuvent être divisés en au moins deux sous-types, y compris classique et non classique. Les monocytes classiques affichent CCR2⁺Ly6C^hauteCX3CR1^faible expression, et les monocytes non classiques démontrent CCR2^–Ly6C^basmarqueurs élevés CX3CR1 ⁵.

En raison de la nécessité de l’analyse quantitative de l’expression des marqueurs, c’est-à-dire des niveaux élevés par rapport aux niveaux faibles/faibles, la cytométrie du flux multi-paramètres est la méthode idéale pour la discrimination entre les monocytes, les macrophages, les microglies et les cellules dendritiques dans l’œil et d’autres tissus. D’autres avantages incluent l’identification des sous-populations, la capacité d’utiliser le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier les populations cellulaires pour l’analyse transcriptomique ou protéomique, et la cartographie du sort. L’inconvénient majeur de la cytométrie du flux multi-paramètres est le manque d’architecture tissulaire. Ceci peut être surmonté par la dissection ophtalmique dans les divers sous-commandements oculaires : cornée, conjonctive, iris, lentille, rétine, et complexe choroïde-sclera. En outre, l’imagerie confirmatoire d’immunofluorescence peut être exécutée, mais est limitée par le nombre de marqueurs et le manque de quantitation robuste.

Les études d’association à l’échelle du génome ont établi un lien entre plusieurs gènes complémentaires et la^{D AMD 16}. L’activation de complément mène à la production d’anaphylatoxine, au recrutement de leucocyte, et à l’inflammation qui en résulte. En complément des souris déficientes en récepteurs, les lésions au laser réduisent le recrutement de phagocytes mononucléaires et la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV)^{zone 17}. De même, le récepteur de chimiokine de motif de C-C 2 (CCR2) souris de KO, qui est déficient dans le recrutement de monocyte au tissu, démontre à la fois le recrutement mononucléaire diminué de phagocyte et la zone induite par laser de CNV^18. Ces données relient le complément et les phagocytes mononucléaires avec le CNV expérimental et peut-être l’AMD néovasculaire. À l’appui de cette association, les récepteurs de complément sont dysregulated sur des monocytes périphériques de sang dans les patients présentant l’AMD^{néovasculaire 19,20.} Ces données démontrent une forte association entre amd et phagocytes mononucléaires.

Dans ce manuscrit, nous utiliserons le modèle expérimental de CNV induit par laser pour caractériser les populations mononucléaires de phagocyte dans l’oeil de souris utilisant la cytométrie de flux multi-paramètres. Le CNV induit au laser est le modèle standard de souris de la DMO néovasculaire, qui a démontré l’efficacité de la thérapie néovasculaire actuelle de la DMO de première^{ligne 21}. Ce protocole décrit l’enucleation des yeux de souris, la dissection oculaire, la digestion en une seule suspension cellulaire, la coloration des anticorps, la détermination des tensions laser à l’aide de commandes de couleur unique, et la stratégie de gating utilisant la fluorescence moins un (FMO) contrôles. Pour une description détaillée du modèle CNV induit au laser, veuillez consulter une publication précédente²². En utilisant ce protocole, nous définirons les microglies, les monocytes, les cellules dendritiques et les populations de macrophages. De plus, nous utiliserons le MHCII et le CD11c pour définir davantage les sous-ensembles de macrophages dans le modèle CNV induit par laser.