هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

يتضمن الجهاز المناعي الفطري أنواع خلايا متعددة تحفز التنشيط والالتهاب. وتشمل الخلايا المناعية الفطرية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الصاري ، والبصلات ، واليوزنوفيليات ، والعدلات ، والبلعات أحادية النوى. وقد تورطت في الفعات أحادية النوى، والتي تتكون من أحادية الخلايا، الضامة، والخلايا التشعبية، في الفيزيولوجيا المرضية من حالات العيون متعددة بما في ذلك التهاب القزحية، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)¹. في هذا البروتوكول، وسوف نركز على تحديد البلعات أحادية النواة باستخدام تحليل cytometric تدفق متعددة المعلمة في نموذج الماوس من أيه أمد neovascular². هذا البروتوكول قابل للتكيف مع نماذج الماوس من اعتلال الشبكية السكري و / أو التهاب القزحية ، ولكن من المستحسن تشريح العين أكثر شمولا بسبب الطبيعة الجهازية لهذه الأمراض.

تعبر البالعات أحادية النوى عن علامات سطح الخلية المتداخلة. خلايا الضامة المقيمة الأنسجة طويلة الأمد وmicroglia تنشأ من صفار ساك المستمدة من السلف 3 erythromyeloid³، في حين إعادة تدوير الضامة والخلايا التشعبة التمييز من النخاع العظمي التكخير الخلايا التكهنة⁴. علامات سطح الخلية الماوس المشتركة monocytes، الضامة، وخلايا التشعب تشمل CD45، CD11b^5،F4/80^6،Cx3cr1^7،وعلامة Iba1⁸داخل الخلية. من أجل التغلب على هذا التحدي ، تحليل النسخ من الضامة ، monocytes ، والخلايا التشعب من أنسجة متعددة يعرف CD64 باعتبارها علامة سطح الخلية الضامة الخاصة^6. وقد وصفت الضامة في القزحية، المشيمية، الجسم الهدّاج، والعصب البصري في عيون صحية³. وبدلاً من ذلك، فإن تحديد هوية الخلية التشعبية أكثر صعوبة؛ الأسلوب الأكثر تحديدا لتحديد الخلية dendritic يتطلب رسم خرائط مصير باستخدام Zbtb46-GFP مراسل الماوس⁹. مستقلة عن هذا الخط مراسل، والتعبير عن CD11c وMHCII بالتزامن مع عدم وجود CD64 يمكن تحديد الخلايا التشجر المحتملة^6،10. وقد تم تحديد الخلايا التشعبية في القرنية، الملتحمة، القزحية، والمشيمية في عيون طبيعية¹¹. Microglia هي الضامة المتخصصة الموجودة في شبكية العين، محمية من قبل حاجز الدم الشبكية، ومستمدة من صفار كيس الخلايا السلف¹². ونتيجة لذلك، يمكن تمييز ميكروجليا الشبكية من الضامة المشتقة من أحادية الخلايا من خلال مستوياتها الخافتة من التعبير CD45¹³ ومستويات عالية من Tmem119، والذي يتوفر كآلية مضادة مضادة للتدفق¹⁴. على microglia التنشيط ، ومع ذلك ، يمكن أن يكون CD45 حتى المنظمة¹⁵ و Tmem119 قد تكون أسفل المنظمة³، مما يدل على تعقيد البيولوجيا microglia وهذا من المرجح أن تكون ذات الصلة في كل من AMD ونموذج الماوس. وأخيراً، يمكن تقسيم أحاديات إلى نوعين فرعيين على الأقل، بما في ذلك الكلاسيكية وغير الكلاسيكية. الكلاسيكية monocytes عرض CCR2⁺Ly6C^عاليةCX3CR1 التعبير^{المنخفض،} وغير الكلاسيكية monocytes شرح CCR2^–Ly6C^منخفضةCX3CR1 علامات^{عالية 5}.

نظرا لضرورة التحليل الكمي للتعبير علامة، أي، مستويات عالية مقابل منخفضة / خافتة، multi-parameter تدفق قياس الخلايا هو الطريقة المثلى للتمييز بين monocytes، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في العين والأنسجة الأخرى. وتشمل المزايا الإضافية تحديد مجموعات فرعية، والقدرة على استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لفرز مجموعات الخلايا لتحليل النسخ أو البروتيوم، ورسم خرائط المصير. العيب الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا عن طريق تشريح العيون في مختلف subcompartmentments العين: القرنية، الملتحمة، قزحية العين، العدسة، شبكية العين، ومجمع المشيمية Sclera. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تصوير المناعة الواعنية، ولكن محدود بعدد العلامات وعدم وجود كمية قوية.

وقد ربطت دراسات الرابطة واسعة الجينوم الجينات تكمل متعددة مع AMD¹⁶. تنشيط مكمل يؤدي إلى إنتاج الحساسية, تجنيد الكريات البيض, والتهاب الناتجة. في مستقبلات مكملة ناقص الفئران، إصابة الليزر يقلل من أحادية النوى الفيتويتي تجنيد وneovascularization المشيمية التي يسببها الليزر (CNV) منطقة¹⁷. وبالمثل، فإن C-C chemokine مستقبلات 2 (CCR2) ماوس بالضربة القاضية، والذي هو نقص في التوظيف أحادية إلى الأنسجة، ويوضح كلا من تجنيد البليغسيت أحادية النواة وأشعة الليزر التي يسببها CNV المنطقة¹⁸. هذه البيانات وصلة تكملة ومونية البلعومات مع CNV التجريبية وربما NEOVASCULAR AMD. دعما لهذا الارتباط، و dysregulated مستقبلات تكملة على monocytes الدم الطرفية في المرضى الذين يعانون من أيه ام دي neovascular^19،20. وتبين هذه البيانات وجود ارتباط قوي بين AMD والبلعات أحادية النوى.

في هذه المخطوطة، سوف نستخدم نموذج CNV المستحث بالليزر التجريبي لتوصيف مجموعات البلعومات أحادية النوى في عين الماوس باستخدام عملية تدفق التدفقات متعددة المعالم. بالليزر التي يسببها CNV هو نموذج الماوس القياسية من أيه امد neovascular، والتي أظهرت فعالية العلاج الحالي الخط الأول NEOVASCULAR²¹. هذا البروتوكول سوف يصف enucleation من عيون الماوس، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ الأجسام المضادة، وتحديد الفولتية الليزر باستخدام ضوابط لون واحد، واستراتيجية الغاء باستخدام الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) الضوابط. للحصول على وصف مفصل لنموذج CNV الذي يسببه الليزر، يرجى الاطلاع على منشور سابق²². باستخدام هذا البروتوكول، سوف نحدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الخلايا التكجرية، والسّكان الضامة. وعلاوة على ذلك، سوف نستخدم MHCII و CD11c لمزيد من تحديد مجموعات فرعية الضامة داخل نموذج CNV الليزر التي يسببها.