Kombineret prækursor isotop mærkning og isoobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing strategi, der er i stand til at øge antallet af prøver, der kan analyseres samtidig med tilgængelige isobaric tags. Inkorporering af en robotplatform har øget den eksperimentelle overførselshastighed, reproducerbarhed og kvantitative nøjagtighed betydeligt.
Vi har indført en høj kapacitet kvantitative proteomics workflow, kombineret prækursor isotop mærkning og isobænsk tagging (cPILOT) i stand til multiplexing op til 22 eller 24 prøver med tandem masse tags eller isobaric N, N-dimethyl leucin isobaric tags, henholdsvis i et enkelt eksperiment. Denne forbedrede prøve multiplexing reducerer massespektrometri erhvervelse gange og øger nytten af de dyre kommercielle isoobaric reagenser. Den manuelle proces med prøvehåndterings- og pipetteringstrin i strategien kan dog være arbejdskrævende, tidskrævende og indføre prøvetab og kvantitative fejl. Disse begrænsninger kan overvindes ved at indarbejde automatisering. Her overførte vi den manuelle cPILOT-protokol til en automatiseret væskehåndteringsenhed, der kan tilberede store prøvenumre (dvs. 96 prøver) parallelt. Generelt øger automatisering gennemførligheden og reproducerbarheden af cPILOT og giver mulighed for bred brug af andre forskere med sammenlignelige automatiseringsenheder.
Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er et uundværligt forskningsredskab til at identificere sygdomsspecifikke biomarkører, forstå sygdomsprogression og skabe kundeemner til terapeutisk udvikling. Dette kan opnås fra en række sygdomsrelaterede kliniske prøver såsom blodserum/plasma, proksimale væsker og væv1,2. Proteomics biomarkør opdagelse og validering har for nylig fået betydelige overvejelser på grund af styrken af prøve multiplexing strategier3,4. Prøveud flerekspifikation er en teknik, der muliggør samtidig sammenligning og kvantificering af to eller flere prøvebetingelser inden for en enkeltMS-injektion 5,6. Prøve multiplexing opnås ved barcoding peptider eller proteiner fra flere prøver med kemiske, enzymatiske eller metaboliske tags og indhente MS oplysninger fra alle prøver i en enkelt MS eller MS / MS eksperiment. Blandt de tilgængelige isobaric tags er isobaric tagging reagenser (iTRAQ), kommercielle tandem masse tags (TMT), og i hus syntetiseret isobaric N, N-dimethyl leucin (DiLeu) reagenser med kapaciteter op til 16-plex7 og 21-plex8, hhv.
Kombineret prækursorisotopmærkning og isobaric tagging (cPILOT) er en forbedret prøve multiplexing teknologi. cPILOT kombinerer isotopmærkning af peptid N-termini med lys [−(CH3)2]og tung [−(13C2H3)2] isotoper ved lav pH (∼2.5), som holder lysinresterne til rådighed for efterfølgende høj pH(8.5) isobaric mærkning ved hjælp af TMT DiLeu eller iTRAQ-tagging3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategiens dobbelte mærkningsordning er afbildet i supplerende figur 1 med to prøver ved hjælp af et eksempel peptid. Nøjagtigheden og præcisionen af den TMT-baserede kvantificering på MS2-niveau kan bringes i fare på grund af tilstedeværelsen af kontaminerende co-isolerede og co-fragmenterede ioner, der betegnes som interferenseffekten15. Denne begrænsning i unøjagtige reporter ion nøgletal kan overvindes ved hjælp af tribrid Orbitrap massespektrometre. For eksempel kan interferenseffekten overvindes ved at isolere en top i et dimethyleret par på MS1-niveauet i massespektrometeret, udsætte den lette eller tunge top for MS2-fragmentering i den lineære ionfælde og derefter udsætte det mest intense MS2-fragment for HCD-MS3 for at få kvantitative oplysninger. For at øge chancerne for at vælge peptider uden lysinaminer til rådighed for at generere reporterioner, en selektiv MS3 erhvervelse baseret på y-1 fragment også kan anvendes og er en tilgang, som kan resultere i en højere procentdel af peptider kvantificerbare med cPILOT9. Kombinationen af let og tung mærkning øger prøve multiplexing kapaciteter med en faktor på 2x til den, der opnås med individuelle isoobaric tags. Vi har for nylig brugt cPILOT til at kombinere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment med DiLeu reagenser16. Derudover er cPILOT blevet anvendt til at studere oxidative post-translationelle modifikationer 14 , herunder proteinnitration17, andre globale proteomer9, og har demonstreret anvendelser på tværs af flere vævsprøver i en Musemodel11 forAlzheimers sygdom.
Robust prøveforberedelse er et kritisk trin i et cPILOT-eksperiment og kan være tidskrævende, besværligt og omfattende. Forbedret prøve multiplexing kræver omfattende pipettering og højt kvalificerede laboratoriepersonale, og der er flere faktorer, der kan stærkt påvirke reproducerbarheden af eksperimentet. F.eks. er omhyggelig håndtering af prøver nødvendig for at sikre lignende reaktionstider for alle prøver og for at opretholde passende bufferpH for lette og tunge dimethylerede prøver. Desuden kan manuel forberedelse af snesevis til hundredvis af prøver medføre en høj eksperimentel fejl. For at reducere variationen i prøveforberedelse, forbedre den kvantitative nøjagtighed og øge den eksperimentelle gennemløb har vi derfor udviklet en automatiseret cPILOT-arbejdsgang. Automatisering opnås ved hjælp af en robot væskehåndteringsenhed, der kan fuldføre mange aspekter af arbejdsprocessen (Figur 1). Prøvepræparatet fra proteinant kvantificering til peptidmærkning blev udført på en automatiseret væskehandler. Den automatiserede væskebehandler er integreret med et PPA (positivetryk) til bufferudvekslinger mellem spe-pladerne (solid phase extraction), orbitalshasker og en varme-/køleanordning. Robotplatformen indeholder 28 dækslokationer, der passer til plader og buffere. Der er to bælg med en griber til at overføre pladerne inden for dækket steder: en 96-kanals fast volumen pipettering hoved (5-1100 μL) og 8 kanal variabel volumen sonder (1-1000 μL). Robotplatformen styres ved hjælp af en software. Brugeren skal trænes professionelt, før der anvendes robotvæskebehandleren. Denne undersøgelse fokuserer på automatisering af den manuelle cPILOT arbejdsgang, som kan være arbejdskrævende til behandling af mere end 12 prøver i et enkelt parti. For at øge gennemløbet af cPILOT approach11overførte vi cPILOT-protokollen til en robotvæskebehandler for at behandle mere end 10 prøver parallelt. Automatiseringen giver også mulighed for lignende reaktioner for hver prøve parallelt under forskellige trin i prøveforberedelsesprocessen, hvilket krævede, at højtuddannede brugere kunne opnå under manuel cPILOT. Denne protokol fokuserer på implementering af den automatiserede væskehåndteringsenhed til udførelse af cPILOT. Denne undersøgelse beskriver protokollen for brug af dette automatiserede system og demonstrerer dens ydeevne ved hjælp af en 22-plex “proof-of-concept” analyse af muselever homogenater.
cPILOT er en forbedret multiplexing-strategi, der kan analysere op til 24 prøver i et enkelt eksperiment. Multiplexing kapacitet afhænger af antallet af tilgængelige isotop og isoobaric tagging kombinationer. Introduktion af TMTpro7, som er i stand til at mærke 16 prøver i enkelt eksperiment, kan skubbe grænserne for cPILOT til 32-plex. cPILOT består af flere pipetteringstrin og kræver omfattende pleje og brugerfærdigheder for at udføre prøveforberedelse. Selv med en ekspertbruger er manuelle fejl uundgåelige, hvilket opfordrer brugen af robotplatforme til at behandle prøver i cPILOT-strategien. Da cPILOT anvender pH-afhængig mærkning af peptiderne, skal pH-punktet opretholdes for lyset og det tunge dimethylerede sæt prøver. Mildt sur-basis pH kan resultere i dimethylering af både N-termini og lysin rester. En fordel ved cPILOT er, at det kun kræver halvdelen af de isobiske tags, da peptid N-termini er optaget af dimethylgrupperne. Dette giver et større antal prøver, der skal mærkes til halv pris. Håndtering af større stikprøvetal kræver, at reagenseksponeringstider er ens for den første og den sidste prøve i et parti. En pipettedispenser, der kan rumme op til 32 prøver parallelt, kan bedst opnås ved brug af robotvæskehåndteringsenheder.
For at behandle flere prøver af cPILOT blev den manuelle arbejdsgang ændret for at omfatte automatisering. Den robotvæske handler, der anvendes i denne undersøgelse har to bælg med 96-kanals og 8-kanals pipetting evner, med en griber til at placere pladerne i de tilgængelige 28 dæk steder. Væskebehandleren er integreret med et positivt trykapparat, orbital shaker og en anordning til opvarmning/afkøling af prøver i 96 brøndpladen. Det positive trykapparat hjælper med at udføre bufferudvekslinger i SPE-pladerne under oprydningen, mens orbitalshaskeren hjælper med at hvirvel/blande prøverne. Robotplatformen blev programmeret til at aspirere og dispensere buffere og prøver til 96-brøndplader, inkubere, vortexprøver og overførselsplader. Væsker med forskellige viskositeter, såsom acetonitril og vand, kræver specifikke pipettering overvejelser, der også kan programmeres til metoden.
CPILOT-arbejdsgangen, der startede fra BCA’s proteinantificering til mærkning af peptiderne med isobiske tags (dvs. Den komplette protokol blev skaleret til at bruge 96 dybe brøndplader, der kan rumme 2 ml pr. brønd. Bufferne blev udarbejdet før forsøgets start og tilsat 96 brøndpladen, således at der kunne foretages en parallel prøveforarbejdning. I denne undersøgelse blev der tilføjet 22 workflow-replikater af muselever homogenat til de dybe brøndplader og taget gennem cPILOT-protokollen. Endelig blev der injiceret en enkelt prøve bestående af de 22-plex equimolar-muselever, der mærkede peptider, til massespektrometeret. De understøttende ionintensiteter svarende til peptidtætheden i prøverne viste, at prøver, der er behandlet med væskebehandleren, har lavere CV’er end den manuelle protokol (ikke viste data). Robotplatformen forbedrede også i høj grad reproducerbarheden af prøvebehandling. Reproducerbarhed og robusthed er meget vigtige faktorer under behandling af et stort antal prøver. Pipetteringsfejl kan føre til fuldstændig fejlfortolkning af dataene, og her leverede robotplatformen lav variation mellem prøverne. Ved hjælp af robotplatformen til cPILOT reducerede det den tid, det tog at forberede prøver. For eksempel krævede den efter at have udviklet den automatiserede metode 2,5 timer at behandle 22 prøver i forhold til 7,5 timer for manuel cPILOT. Der er forsøg i gang i vores laboratorium for yderligere at evaluere sammenligninger af manuelle og automatiserede cPILOT-arbejdsgange. Baseret på tidligere rapporter fra vores laboratorium var CV%s af proteinreporterionintensiteter i den manuelle cPILOT i gennemsnit 20% med nogle afvigende værdier, der oversteg denneværdi 12.
cPILOT er en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidniveau, der kan bruges til enhver prøvetype som celler, væv og kropsvæsker. cPILOT tilbyder forbedret prøve multiplexing og med inkorporering af automatisering kan lette høj-throughput prøve multiplexing i proteomics. Denne gennemløb er nødvendig for yderligere at fremme sygdom og biologisk forståelse og biomarkør opdagelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Vanderbilt University Start-up fonde og NIH pris (R01GM117191) til RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |