O manuscrito apresenta amostragem in loco de tumores cerebrais humanos com microextração de fase sólida seguida por seu perfil bioquímico para a descoberta de biomarcadores.
Apesar da variedade de ferramentas disponíveis para diagnóstico e classificação do câncer, métodos que permitem a caracterização rápida e simples dos tumores ainda estão em necessidade. Nos últimos anos, a espectrometria de massa tornou-se um método de escolha para o perfil não-alvo de composto discriminatório como potenciais biomarcadores de uma doença. Os biofluidos são geralmente considerados como matrizes preferenciais, dada a sua acessibilidade e processamento mais fácil da amostra, enquanto o perfil tecidual direto fornece informações mais seletivas sobre um determinado câncer. A preparação de tecidos para a análise através de métodos tradicionais é muito mais complexa e demorada e, portanto, não é adequada para análise rápida no local. O trabalho atual apresenta um protocolo que combina preparação e extração de amostras de pequenas moléculas no local, imediatamente após a ressecção do tumor. O dispositivo de amostragem, do tamanho de uma agulha de acupuntura, pode ser inserido diretamente no tecido e depois transportado para o laboratório próximo para análise instrumental. Os resultados das análises metabolômicas e lipidômicas demonstram a capacidade da abordagem para o estabelecimento de fenótipos de tumores relacionados à origem histológica do tumor, malignidade e mutações genéticas, bem como para a seleção de compostos discriminatórios ou biomarcadores potenciais. A natureza não destrutiva da técnica permite o desempenho subsequente de testes rotineiramente utilizados, por exemplo, testes histológicos, nas mesmas amostras utilizadas para análise spme, permitindo assim a obtenção de informações mais abrangentes para suportar diagnósticos personalizados.
Ressonância Magnética (RM) e Tomografia Computadorizada (TC) são os principais métodos utilizados para a análise em tempo real das lesões cerebrais. A diferenciação do tumor cerebral é geralmente baseada na histopatologia com coloração adicional e técnicas imunohistoquímicas avançadas. De acordo com as orientações atualizadas sobre tumores nervosos centrais emitidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2016, os testes genéticos são cruciais para a diferenciação e classificação desses tumores1. A diferenciação e classificação dos tumores permitem que os médicos escolham o tratamento mais eficaz para um determinado tipo de tumor, ampliando assim a expectativa de vida do paciente. Infelizmente, apesar da disponibilidade de tais métodos avançados para auxiliar os médicos na seleção de uma terapia ideal para seus pacientes, a expectativa de vida dos pacientes diagnosticados com glioblastoma (glioma de grau IV) é de apenas cerca de 15-16 meses2. Mesmo com a sofisticação e maior precisão dos referidos métodos de imagem e histológicos como ferramentas de diagnóstico, ainda há uma grande necessidade de novas técnicas capazes de oferecer informações complementares para auxiliar os médicos nas decisões relativas ao curso do tratamento. Ao longo dos últimos anos, várias novas abordagens baseadas na espectrometria de massa foram propostas para análise intraoperatória do câncer3,4. O potencial de microextração de fase sólida (SPME), método aqui apresentado, como ferramenta rápida de análise no local, já foi demonstrado em uma variedade de estudos5. O manuscrito atual mostra uma das aplicações clínicas do método, metabolômica não-alvo e lipidomics de tumores cerebrais humanos. Investigações não-alvo apresentam um importante ponto de partida na descoberta de potenciais biomarcadores. Uma vez estabelecidos, tais biomarcadores podem então ser usados como referências diagnósticas para diferenciar entre tumores usando a mesma tecnologia acoplada à instrumentação no local.
SPME é uma técnica de preparação de amostras baseada em equilíbrio que extrai pequenas moléculas de matrizes amostrais com o uso de pequenas quantidades de fase de extração. Na configuração mais tradicional do dispositivo (sonda) da SPME, uma fibra é revestida com uma fase de extração adequada e imobilizada em um suporte sólido, ou seja, um fio metálico5,6. Revestimentos e dispositivos biocompatíveis (sondas) permitem a extração diretamente de matrizes biológicas complexas sem pré-tratamento amostral, por exemplo, homogeneização e filtração. Através do processo de extração, os analitos são particionados entre a fase de extração e a matriz amostral em proporção às suas concentrações iniciais. Se a extração for realizada por tempo suficiente, então o equilíbrio é alcançado. Embora a extração em equilíbrio forneça a maior sensibilidade e reprodutibilidade possível, a extração pré-equilíbrio também é possível e até preferível em alguns casos, ou seja, amostragem in vivo, onde restrições de tempo associadas à amostragem no local (por exemplo, salas operacionais ou de emergência) necessitam de extrações rápidas. O perfil de tempo de extração de um determinado analito é geralmente influenciado pelas propriedades físico-químicas do analito, a matriz sendo amostrada, o tipo de sorbent utilizado e várias outras condições de extração. A infinidade de fatores que regem sua cinética extração torna praticamente impossível garantir a extração de equilíbrio de todos os compostos quando análises não-marcadas, como metabolômica ou lipidomics são realizadas. Pelas razões acima mencionadas, o tempo de extração do protocolo atual foi definido arbitrariamente para garantir sensibilidade satisfatória e cobertura de metabólitos, por um lado, e praticidade para uso no local, por outro.
Deve-se ressaltar que o tamanho muito pequeno das sondas utilizadas para a extração de amostras de tecidos só causa danos mínimos ao tecido, enquanto o procedimento amostral em si não consome nenhum tecido, mas quantidades muito pequenas de pequenas moléculas da área amostrada; portanto, a mesma amostra pode ser utilizada para testes de rotina, ou seja, histológico ou genético, possibilitando a obtenção de informações essenciais e complementares a partir da mesma amostra. Tais dados complementares e abrangentes permitiriam uma melhor compreensão da biologia tumoral, facilitando a descoberta de novos alvos de tratamento. A exploração desse método aumenta ainda mais a possibilidade de diagnósticos intraoperatórios no local ao determinar biomarcadores-alvo.
Abaixo apresentamos protocolos para amostragem de tumores cerebrais no local para análises metabolômicas e lipidómicas e processamento de dados.
Metabolômica não-alvo e lipidomia são comumente utilizadas em estudos focados na identificação de biomarcadores tumorais. No entanto, na maioria dos casos, os pesquisadores procuram compostos que possam ser usados para a triagem da doença. Consequentemente, as amostras biológicas preferidas são sangue ou urina devido ao seu acesso relativamente fácil. A análise do tecido tumoral é realizada principalmente para entender os mecanismos por trás da doença, caracterizar diferentes tipos de tumores, etc. A análise no local dos biomarcadores tumorais raramente é realizada, pois tais aplicações requerem uma extensa preparação amostral. Alternativamente, estratégias baseadas na análise em tempo real de perfis teciduais sem pré-seleção de biomarcadores específicos estão ganhando a atenção da comunidade médica3,4. A solução aqui apresentada fornece outra perspectiva sobre o processamento de tecidos no local, revelando o tipo de informação que pode ser obtida através desses métodos.
A combinação de amostragem, preparação de amostras e extração torna o SPME uma ferramenta muito útil para análise no local. Além disso, a falta de consumo de tecidos durante a amostragem permite o uso adicional das mesmas amostras para análise biomarcadora e testes de rotina (genotipagem, análise histológica), adicionando novas informações aos resultados dos testes padrão. O dispositivo de amostragem tem um design muito simples, seu funcionamento é muito fácil, e nenhum treinamento especial é necessário para realizar a extração em si. No entanto, alcançar resultados confiáveis requer muito mais do que apenas o manuseio adequado dos dispositivos. Para realizar adequadamente o experimento, é preciso entender o processo de extração, a natureza da amostra e estar ciente de possíveis erros que podem influenciar os dados.
É importante considerar a heterogeneidade do tecido cancerígeno10; os tumores amostrados podem conter partes submetidas a necrose, calcificação e hipóxia, e cada um desses processos será refletido no metabolome e lipidome atingidos, influenciando assim os resultados. Portanto, recomenda-se que a amostragem de resolução espacial seja realizada por inserção de várias fibras em diferentes partes do tecido cancerígeno, ou alternativamente, que um revestimento mais longo seja usado para penetrar em todo o tumor de modo a obter informações médias sobre o tumor. Se o método de amostragem de resolução espacial for realizado, as fibras podem ser todas desordenadas em um solvente de desorção; isso não só permitiria a obtenção de informações gerais sobre o tumor, mas também aumentaria a sensibilidade da análise. Alternativamente, a desorção de fibras individuais em frascos separados permitiria que as investigações descobrissem a diversidade interna do tumor cerebral, que consiste no núcleo construído de células cancerosas, e na zona externa, que é a borda do tecido saudável. Partes mais profundas do tumor geralmente são mais danificadas pelos processos relacionados ao câncer11. No entanto, os pesquisadores devem ter em mente que essa opção compromete a sensibilidade do método e o número total de compostos detectáveis. No trabalho atual, foi utilizado um revestimento de 7 mm; esse comprimento foi considerado ideal para vários tamanhos de tumores incluídos no estudo. Os revestimentos penetraram os tumores e, portanto, forneceram resolução não especial, mas dados médios em toda a amostra. Independentemente do protocolo selecionado, é importante que o mesmo protocolo seja seguido durante todo o estudo, incluindo o número de fibras utilizadas para amostragem individual, o comprimento do revestimento, o tempo de extração e todos os outros fatores delineados neste trabalho.
É importante controlar a qualidade da análise. O QC agrupado (ver etapas 4.7 e 7.7 no protocolo) deve ser preparado e usado para monitorar a estabilidade do instrumento durante o execução de todo o lote amostral. Os controles em branco (ver passo 2.8) podem ser usados posteriormente para preparar uma “lista de exclusão” para eliminar sinais de contaminantes originários de solventes ou fabricação de fibras. Em ocasiões especiais, como o risco de contaminação, é necessário realizar amostragem de luvas, mesas, aparelhos ou quaisquer outras superfícies que possam representar um risco de contaminação. Nesses casos, a preparação de fibras, o tempo de extração e os protocolos de desorção são os mesmos das amostras.
As análises metabolômicas e lipidômicas são focadas inteiramente em pequenas moléculas (menos de 1.500 Da) que aparecem em um organismo ou componentes específicos do organismo, como órgãos específicos, tecidos, fluidos, células, etc. Metabolômicas e lipidômicas oferecem um instantâneo de alterações bioquímicas ocorridas no corpo, e no caso do câncer, integram informações relacionadas ao genoma, histologia e malignidade do tumor. Essas ciências omicesiárias criam uma conexão entre fisiologia e fenótipo, pois os metabólitos são mais elevados na escada bioquímica do que proteínas ou genes12. Ao compreender o metabolo e lipidome dos tumores cancerígenos, estamos mais perto de descobrir o fenótipo entre todas as ciências -omics à medida que esses ramos de estudo oferecem um conhecimento mais profundo das mudanças dinâmicas das moléculas como resposta dos organismos vivos a vários estímulos. Conforme apresentado neste trabalho, os dados obtidos em uma amostragem correspondem à histologia do câncer, seu grau de malignidade, e reflete mudanças ocorridas no nível do genoma. Nos gliomas, como o tipo de câncer de interesse neste estudo, as informações escondidas no genoma são particularmente importantes, pois um tratamento personalizado é desenvolvido com base nos resultados dos testes genéticos. Mutações particulares são marcadores prognósticos dos resultados da quimioterapia ou radioterapia. Como demonstrado aqui, a seleção de biomarcadores refletindo uma determinada mutação é possível com a estratégia proposta. Marcadores de mutação, bem como tipos adicionais de descritores como aqueles que indicam o grau de malignidade do tumor também podem ser usados para apoiar métodos de diagnóstico de rotina.
A biópsia química ex vivo com o uso de fibras de microextração de fase sólida é o primeiro passo na aplicação do método para diagnósticos intraoperatórios. O método pode ser facilmente adotado para amostragem in vivo pendente de permissão de Conselhos éticos apropriados. Nesses casos, a esterilização dos dispositivos SPME deve ser realizada de acordo com os procedimentos de esterilização aceitos do hospital onde a amostragem deve ser realizada, ou seja, esterilização automática ou óxido de etileno. As fibras pré-condicionadas e esterilizadas devem ser mantidas em embalagens lacradas rotuladas com data de validade da esterilização. É importante notar que as fibras não devem ser limpas com o uso de surfactantes. Tal procedimento pode causar alterações inespecíficas na composição sorbent, impactando assim a extração de analitos. Nos estudos aqui descritos, foi utilizado um período de extração de 30 minutos, mas outros relatos validam que tempos mais curtos podem produzir resultados satisfatórios nos estudos in vivo 13. Huq et al. mostraram que o tempo de equilíbrio de analito é alcançado mais rapidamente no tecido, como uma matriz complexa, do que nas matrizes simples14. No entanto, a reprodutibilidade dos resultados obtidos pode ser comprometida em períodos de extração mais curtos, uma vez que mais analitos serão extraídos em condições pré-equilíbrio; portanto, deve ser implementado um controle de tempo preciso.
Ambas as ciências omics exploradas como parte deste trabalho têm excelente potencial como ferramentas de descoberta de biomarcadores. Uma vez que os biomarcadores são selecionados ou um modelo quimiométrico é estabelecido, diagnósticos médicos baseados na determinação de metabólitos através de métodos aplicáveis para investigações no local, como a abordagem SPME descrita neste trabalho, podem ser desenvolvidos e implementados como parte de diagnósticos de rotina.
O protocolo proposto no presente manuscrito descreve como realizar análises metabolômicas e lipidômicas não-diretas do tecido cancerígeno utilizando microextração de fase sólida para triagem de potenciais biomarcadores. Destina-se a permitir a extração de compostos representativos, diferenciação de tumores e identificação de compostos discriminatórios caracterizando um determinado câncer, ou seja, potenciais biomarcadores. As análises não-ágeis com o SPME descritas neste artigo representam um ponto de partida no desenvolvimento de diagnósticos intraoperatórios rápidos, onde um painel selecionado de compostos pode ser determinado sem a necessidade de triagem de todos os compostos presentes na amostra. No interesse de resultados diagnósticos rápidos, as sondas SPME utilizadas para extração no local poderiam ser diretamente acopladas à instrumentação analítica localizada na unidade hospitalar. Extrações simples realizadas com preparação mínima da amostra seguida de análise livre de cromatografia reduziriam significativamente o tempo total de horas para poucos minutos, como já descrito para o monitoramento de medicamentos15.
The authors have nothing to disclose.
O estudo foi apoiado pela bolsa Harmonia 2015/18/M/ST4/00059 do Centro Nacional de Ciências. Os autores gostariam de reconhecer a MilliporeSigma, um negócio da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha, por fornecer os dispositivos SPME usados neste trabalho. O negócio de ciências da vida da Merck opera como MilliporeSigma nos EUA e Canadá. Além disso, os autores gostariam de agradecer à Thermo Fisher Scientific pelo acesso ao espectrômetro de massa Q-Exactive Focus orbitrap.
Contribuições dos autores: JB: otimização da preparação da amostra e parâmetros de LC-MS, desempenho de experimentos SPME-LC-MS, análise de dados, análise estatística e interpretação de dados e elaboração de manuscritos relacionados à parte lipidômica; PZG: coordenação e desempenho da maioria das amostrades hospitalares, otimização dos parâmetros de amostragem e preparação da amostra, desempenho de experimentos SPME-LC-MS, análise de dados, análise estatística e interpretação de dados, elaboração de manuscritos relacionados à parte metabolômica; MG – auxílio na otimização da preparação da amostra, método LC-MS e análise de dados relacionados à parte lipidóica; KG: co-desempenho das amostras de SPME e otimização da amostragem e preparação da amostra, análise SPME-LC-MS relacionada à parte metabolômica; KC: desempenho de diversas amostras de SPME no hospital, assistência na otimização da amostragem, preparação da amostragem e análise de dados relacionados à parte metabolômica; KJ: desempenho de diversas amostras de SPME no hospital, assistência na análise lipidóica; DP: realização de procedimentos cirúrgicos, recrutamento dos pacientes; JF: realização de procedimentos cirúrgicos, recrutamento dos pacientes; MH: realização de procedimentos cirúrgicos, coordenação da parte clínica da pesquisa; BB: conceito, supervisão de coordenação do projeto e elaboração de manuscritos, realização de diversas amostragems
acetic acid | Honeywell | 49199 | Mobile phase additive, LCMS grade |
acetonitrile | Honeywell | 34967 | HPLC solvent, LCMS grade |
ammonium acetate | Honeywell | 14267 | Mobile phase additive, LCMS grade |
BenchMixer MultiTube Vortexer | Benchmark Scientific | BV1010* | Vortex mixer |
caps | Agilent | 5183-2076 | Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa |
Compound Discoverer 2.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm × 2.1 mm, 3 μm | Supelco | 567571-U | Guard Column |
Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC Column |
formic acid | Honeywell | 56302 | Mobile phase additive, LCMS grade |
glass vial inserts 250ul , deactivated | Agilent | 5181-8872 | |
glass vial inserts 350ul | Agilent | 5188-5321 | |
glass vials 1.5ml | Agilent | 5183-2030 | |
glass vials, 2 mL (amber, deactivated) | Agilent | 5183-2072 | |
glass vials, 2mL | Agilent | 5182-0715 | |
HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC Column |
isopropanol | Honeywell | 34965 | HPLC solvent, LCMS grade |
LipidSearch 4.1 | Thermo Scientific | software for data processing | |
Metaboanalyst | Xia Lab @ McGill | online software for statistical analysis (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis. Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 ) | |
methanol | Honeywell | 34966 | HPLC solvent, LCMS grade |
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88323 | |
Pierce Negative Ion Calibration Solution | Thermo Scientific | 88324 | |
Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | 726049 | Mass Spectrometer |
SecurityGuard cartridge for HILIC, 4 mm × 2.0 mm | Phenomenex | KJ0-4282 | Guard Column |
SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC Column |
SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Supelco | 1504360001 | Guard column |
SPME LC fiber probes, C18 | Supelco | custom order | comercial probes: 57281-U; probes used in the experiment were not needle assembled and were precut to the length described in the protocol |
SPME LC fiber probes, mixed Mode | Supelco | custom order | |
UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | 5200.0345 | HPLC system |
water | Merck | 1153331000 | HPLC solvent, LCMS grade |
XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC Column |
XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge, 3.5 µm, 3.9×5 mm | Waters | 186007813 | Column cartidge |