JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Published: May 08, 2020
doi:
10.3791/61258
,
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Abstract

Polinükleotid kinazlar (PNKs) DNA ve RNA oligonükleotidlerinin 5′ hidroksil ucunun fosforilasyonını katalize eden enzimlerdir. PNK’ların etkinliği doğrudan veya dolaylı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Burada sunulan bir floresan etiketli oligonükleotid substrat ve poliakrilamid jel elektroforez dayanan PNK aktivitesini ölçmek için doğrudan, in vitro bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, fosforlu ürünlerin çözünürlüğünü sağlarken, radyoetiketli yüzeylerin kullanımından kaçınılır. Protokol, fosforilasyon reaksiyonu nasıl ayarlanacağını, büyük poliakrilamid jellerinin nasıl hazırlanacağını ve çalıştırılabildiğini ve reaksiyon ürünlerinin nasıl ölçülmesini ayrıntılarıyla anlatır. Bu sataşma en teknik olarak zorlu kısmı dökülen ve büyük poliakrilamid jelleri çalışan; böylece, ortak zorlukların üstesinden gelmek için önemli ayrıntılar sağlanmaktadır. Bu protokol Grc3 için optimize edildi, bağlayıcı ortağı ile zorunlu bir pre-ribozomal RNA işleme kompleksi içine monte bir PNK, Las1 nükleaz. Ancak, bu protokol diğer PNK enzimlerinin aktivitesini ölçmek için uyarlanabilir. Ayrıca, bu tetkik de reaksiyonun farklı bileşenlerinin etkilerini belirlemek için değiştirilebilir, nükleozit trifosfat gibi, metal iyonları, ve oligonükleotidler.

Introduction

Polinükleotid kinazlar (PNK) DNA onarımı ve,ribozom montaj1,2,3,4,5gibi birçok DNA ve RNA işleme yollarında kritik rol oynamaktadır., Bu temel enzimler terminal (gama) monofosfatının nükleozit trifosfattan (NTP, en sık ATP) nükleotit substratının 5′ hidroksil ucuna transferini katalizler. En iyi karakterize PNKs biri bakteriyofaj T4 PNK, geniş substrat özgüllüğü vardır ve ağır bir DNA veya RNA substrat5terminus üzerine radyoaktif izotop etiketleri dahil etmek için moleküler biyoloji laboratuvarları tarafından kullanılan 6,7,8,9,10,11,12. Bir PNK enziminin başka bir örneği CLP1, Eukarya bulunan, Eubacteria, ve Arke, ve çeşitli RNA işleme yollarıkarıştığı 4,13,14,15.

Tarihsel olarak, polinükleotid kizaz aktivitesiölçmek en tahliller radyoaktif izotop etiketleme ve sonraki otoradyografi5,bağlıdır ,16. Son yıllarda ek tahliller bir dizi pnk aktivitesini ölçmek için geliştirilmiştir, tek molekül yaklaşımları da dahil olmak üzere, mikroçip elektroforez, moleküler işaretleri, yanı sıra kolorimetrik ve parlaklık tabanlı tahliller17,18,19,20,21,22. Bu yeni yaklaşımların çoğu gelişmiş algılama limitleri sağlarken ve radyoaktivite kullanımını önlemek, her maliyet gibi dezavantajları vardır, immobilize reçine güven, ve substrat seçiminde sınırlamalar.

Grc3 pre-ribozomal RNA2,,,3,23işlenmesinde önemli bir rol oynayan bir polinükleotid kinaz olduğunu. Grc3 endoribonuclease Las1 ile zorunlu bir kompleks oluşturur, hangi iç Transkripsiyonu Spacer cleaves 2 (ITS2) pre-ribozomal RNA3. Las1 tarafından ITS2 dekolte daha sonra Grc3 kinizaz3tarafından fosforile bir 5 ‘hidroksil barındıran bir ürün üretir. Grc3’ün nükleotit ve substrat özgüllüğünü araştırmak için, farklı oligonükleotid substratlarının test edilmesine izin veren ucuz bir test gerekiyordu. Bu nedenle floresan etiketli substratlar kullanılarak PNK fosforilasyon titreti geliştirilmiştir. Bu tsur, Grc3’ün fosforil transfer aktivitesi için herhangi bir NTP kullanabileceğini belirlemek için başarıyla kullanıldı, ancak ATP24’ünlehine. Bu protokol, grc3’ün pnk aktivitesini, ribozomal RNA substratının bir RNA mimiküzerinde ölçmek için orijinal testini uyarlar (SC-ITS2, Tablo 1). Bu floresan tabanlı yaklaşımın zorlu bir yönü fosforlu ve fosforile olmayan yüzeyleri etkili bir şekilde çözmek için büyük poliakrilamid jeller güven. Protokol, bu büyük jellerin nasıl döküleceklerine ve bunu yaparken ortak tuzaklardan nasıl kaçınılacaklarına dair özel ayrıntılar sağlar.

RNA ile çalışmak, bozulmaya karşı güçlü bir şekilde duyarlı olduğu için özel bir bakım gerektirir. Ribonükleaz kontaminasyonunu sınırlamak için atabileceğiniz basit önleyici adımlar vardır. RNase inhibitörü içeren bir temizlik maddesi ile kolayca tedavi edilebilen ayrı bir RNA iş istasyonu genellikle yararlıdır. Numuneleri işlerken her zaman eldiven takmak ve RNase içermeyen sertifikalı sarf malzemelerinin kullanılması gereklidir. Su başka bir yaygın kontaminasyon kaynağı olduğundan, taze arıtılmış su kullanmak ve 0,22 μm filtre kullanarak tüm çözümleri sterilize etmek en iyisidir.

Protocol

1. Hazırlık Arabellek ve reaktifleri hazırlayın. Toplam 1 m Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M sodyum klorür, 2,5 μL 2 M magnezyum klorür, 100 μL (v/v) gliserol ve 1 mL’lik rNase içermeyen suyu birleştirerek 1x Reaksiyon Tamponu yapın. 4,8 g üre, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL %1 (w/v) bromofenol mavisi ve RNase içermeyen suyu birleştirerek üre yükleme boyası yapın. 108 g Tris baz, 55 g borik asit, 40 mL 0,5 M EDTA (pH = 8,0) ve Toplam 1 L…

Representative Results

Sabit miktarda Las1-Grc3 kompleksi bulunan ATP titrasyonunun jelini inkar eden başarılı bir temsilci Şekil 1’degösterilmiştir. Enzimin eklenmesi, SC-ITS2 RNA substratının Las1 aracılı RNA bölünmesiile sonuçlandı ve tanımlanmış bir RNA parçasına (5-OH C2 RNA) yol açtı. ATP’nin eklenmesi yle C2 RNA parçası Grc3 PNK (5-P C2 RNA) tarafından fosforlandı. Denaturing jellerde fosforilasyonlu RNA fosforlu olmayan muadili daha hızlı göç ed…

Discussion

Tanımlanan floresan etiketli nükleotit substratlar üzerinde Grc3 PNK kinaz aktivitesini ölçmek için bir töz. Bu protokol Reaksiyon Tamponu ve oligonükleotid substratuyarlayarak diğer PNK enzimlerini karakterize etmek için uygulanabilir. Örneğin, protokol EDTA bir izleme miktarı için çağırır. EDTA eklenmesi iki nedenden dolayı yararlıdır: Birincisi, bu yaklaşım karışımı kirlenmiş metallerin eser miktarda enzim bağlanmasını engelleyerek magnezyum bağlı Grc3 lehine. İkinci olarak, az miktar…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Andrew Sikkema ve Andrea Kaminski’ye bu el yazmasının eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247′ den R.E.S) ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR; 146626 to M.C.P).

Materials

0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Bioquímica. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Polynucleotide KinasePhosphorylationDNARNASubstrateNonradioactive AssayAcrylamide GelDenaturing GelUreaTBE BufferRNA Enzyme Kinase ReactionsATP SubstrateQuenchingDownstream Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image