Nonradioactive Analys för att mäta Polynukleotid Fosforylering av små Nukleotid Substrat
Summary
Detta protokoll beskriver en nonradioactive assay att mäta kinas aktivitet av polynucleotide kinases (PNKs) på små DNA och RNA substrat.
Abstract
Polynukleotidkinaser (PNKs) är enzymer som katalyserar fosforylering av 5′ hydroxyländen av DNA och RNA oligonukleotider. PK:rnas verksamhet kan kvantifieras med hjälp av direkta eller indirekta tillvägagångssätt. Presenteras här är en direkt, in vitro-strategi för att mäta PNK verksamhet som bygger på en fluorescerande-märkt oligonukleotid substrat och polyakrylamid gel elektrofores. Detta tillvägagångssätt ger upplösning av de fosforylerade produkterna samtidigt som man undviker användning av radiomärkta substrat. Protokollet beskriver hur man ställer in fosforyleringsreaktionen, förbereder och kör stora polyakrylamidgeler och kvantifierar reaktionsprodukterna. Den mest tekniskt utmanande delen av denna analys är hälla och köra de stora polyakrylamide geler; således lämnas viktiga detaljer för att övervinna gemensamma svårigheter. Detta protokoll optimerades för Grc3, en PNK som monterar in i ett obligate pre-ribosomal RNA-bearbeta komplex med dess bindande partner, Las1-nucleaseen. Detta protokoll kan dock anpassas för att mäta aktiviteten hos andra PNK-enzymer. Dessutom kan denna analys också modifieras för att bestämma effekterna av olika komponenter i reaktionen, såsom nukleosidtrifosfat, metalljoner, och oligonukleotider.
Introduction
Polynukleotid kinaser (PNK) spelar kritiska roller i många DNA och RNA bearbetning vägar, såsom DNA reparation och ribosom montering1,2,3,4,5. Dessa fundamentala enzymer katalyserar överföringen av terminalen (gamma) monofosfat från en nukleosid triphosphate (NTP, oftast ATP) till 5′ hydroxyl slutet av en nukleotid substrat. En av de mest väl karakteriserade PNKs är bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet och är kraftigt utnyttjad av molekylärbiologiska laboratorier för att införliva radioaktiva isotopetiketter på 5-ändstationen av ett DNA- eller RNA-substrat6,7,8,9,10,11,12. Ett annat exempel på ett PNK-enzym är CLP1, som finns i Eukarya, Eubacteria, och Archaea, och är inblandad i flera RNA bearbetning vägar4,13,14,15.
Historiskt sett är de flesta analyser som mäter polynukleotid kinas aktivitet beroende av radioaktiv isotop märkning och efterföljande autoradiografi5,16. Under de senaste åren har ett antal ytterligare analyser utvecklats för att mäta PNK aktivitet, inklusive enmolekyl metoder, mikrochipelektrofores, molekylära fyrar, samt koloritiska och luminimetriska analyser17,18,19,20,21,22. Medan många av dessa nya metoder ger förbättrade detektionsgränser och undvika användning av radioaktivitet, har var och en nackdelar, såsom kostnad, beroende av immobiliserad harts, och begränsningar i substrat val.
Grc3 är en polynukleotidkinas som spelar en central roll i bearbetningen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 bildar ett obligate komplex med endoribonucleaseen Las1, som klyver den inre Transkriberade Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Klyvning av ITS2 genom Las1 genererar en produkt som hyser en 5′ hydroxyl som därefter fosforyleras av Grc3-kinasen3. För att undersöka nukleotid och substrat specificitet Av Grc3, en billig analys som tillät testning av olika oligonukleotid substrat krävdes. Därför utvecklades en PNK fosforyleringsanalys med hjälp av fluorescerande-märkta substrat. Denna analys användes framgångsrikt för att fastställa att Grc3 kan utnyttja någon NTP för fosforyl överföring verksamhet, men gynnar ATP24. Detta protokoll anpassar den ursprungliga analysen för att mäta PNK-aktivitet av Grc3 på en RNA-härma av dess pre-ribosomala RNA-substrat (SC-ITS2, tabell 1). En utmanande aspekt av denna fluorescensbaserade strategi är beroendet av stora polyakrylamidgeler för att effektivt lösa fosforylerade och icke-fosforylerade substrat. Protokollet ger specifika detaljer om hur man häller dessa stora geler och undvika vanliga fallgropar när du gör det.
Att arbeta med RNA kräver särskild omsorg eftersom det är starkt mottagligt för nedbrytning. Det finns enkla förebyggande åtgärder man kan vidta för att begränsa föroreningen av ribonukleas. En separat RNA-arbetsstation som enkelt kan behandlas med ett RNase-hämmare-innehållande rengöringsmedel är ofta till hjälp. Alltid bär handskar när du hanterar prover och användning av RNase-fria certifierade förbrukningsvaror är nödvändig. Eftersom vatten är en annan vanlig föroreningskälla är det bäst att använda nyrenat vatten och sterilisera alla lösningar med hjälp av ett 0,22 μm-filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs är en analys för att mäta kinas aktivitet av Grc3 PNK på fluorescerande-märkt nukleotid substrat. Detta protokoll kan tillämpas för att karakterisera andra PNK enzymer genom att anpassa Reaction Buffer och oligonukleotid substrat. Till exempel anropar protokollet en spårningsmängd EDTA. Tillsats av EDTA är fördelaktigt av två skäl: För det första gynnar detta tillvägagångssätt magnesium-bundna Grc3 genom att förhindra enzymet från att binda till spårmängder av förorenande metaller i blandn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Andrew Sikkema och Andrea Kaminski för deras kritiska läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us-medborgareinstitut av miljö- vård- vetenskaper (NIEHS; ZIA ES103247 till R.E.S) och Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 till M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
Referências
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Bioquímica. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
