Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag
Summary
Denne protokollen beskriver en ikke-radioaktiv analyse for å måle kinaseaktiviteten til polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.
Abstract
Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer som katalyserer fosforyleringen av 5′ hydroksylende dna og RNA oligonukleotider. Aktiviteten til PNKs kan kvantifiseres ved hjelp av direkte eller indirekte tilnærminger. Presentert her er en direkte, in vitro tilnærming for å måle PNK aktivitet som er avhengig av en fluorescerende merket oligonucleotide substrat og polyakrylamid gel elektroforese. Denne tilnærmingen gir oppløsning av fosforylert produkter samtidig som du unngår bruk av radiomerkede underlag. Protokollen beskriver hvordan man setter opp fosforyleringsreaksjonen, forbereder og kjører store polyakrylamidgeler og kvantifiserer reaksjonsproduktene. Den mest teknisk utfordrende delen av denne analysen er å helle og kjøre de store polyakrylamidgelene; Dermed er viktige detaljer for å overvinne vanlige vanskeligheter gitt. Denne protokollen ble optimalisert for Grc3, en PNK som monteres i et obligatorisk pre-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-kjernen. Denne protokollen kan imidlertid tilpasses for å måle aktiviteten til andre PNK-enzymer. Videre kan denne analysen også endres for å bestemme effekten av forskjellige komponenter i reaksjonen, for eksempel nukleosidtrifosfat, metallioner og oligonukleotider.
Introduction
Polynukleotid kinases (PNK) spille kritiske roller i mange DNA og RNA behandlingsveier, for eksempel DNA reparasjon og ribosommontering 1,2,3,4,5. Disse grunnleggende enzymene katalyserer overføringen av terminalen (gamma) monofosfat fra et nukleosidtriafosfat (NTP, oftest ATP) til 5′ hydroksylende av et nukleotidsubstrat. En av de mest godt karakteriserte PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat spesifisitet og er tungt utnyttet av molekylærbiologi laboratorier for å innlemme radioaktive isotop etiketter på 5 terminus av et DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et annet eksempel på et PNK-enzym er CLP1, som finnes i Eukarya, Eubacteria og Archaea, og er innblandet i flere RNA-behandlingsveier4,,13,,14,,15.
Historisk sett er de fleste analyser som måler polynukleotidkinaseaktivitet avhengig av radioaktiv isotopmerking og påfølgende autoradiografi5,16. I de senere årene har en rekke ekstra analyser blitt utviklet for å måle PNK-aktivitet, inkludert enkeltmolekyltilnærminger, mikrochipelektroforese, molekylære beacons, samt kolorimetriske og luminescence-baserte analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange av disse nye tilnærmingene gir forbedrede deteksjonsgrenser og unngår bruk av radioaktivitet, har hver av dem ulemper, for eksempel kostnader, avhengighet av immobilisert harpiks og begrensninger i substratvalg.
Grc3 er en polynukleotid kinase som spiller en avgjørende rolle i behandlingen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligatorisk kompleks med endoribonuclease Las1, som cleaves den interne transkriberte Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Cleavage av ITS2 av Las1 genererer et produkt som huser en 5 ‘hydroxyl som senere fosforylert av Grc3 kinase3. For å undersøke nukleotid og substrat spesifisitet av Grc3, en billig analyse som tillot testing av forskjellige oligonukleotid underlag var nødvendig. Derfor ble det utviklet en PNK fosforyleringsanalyse ved hjelp av fluorescerende merkede substrater. Denne analysen ble brukt til å fastslå at Grc3 kan bruke en hvilken som helst NTP for fosforyloverføringsaktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokollen tilpasser den opprinnelige analysen for å måle PNK-aktiviteten til Grc3 på en RNA-etterligning av det pre-ribosomale RNA-substratet (SC-ITS2, tabell 1). Et utfordrende aspekt ved denne fluorescensbaserte tilnærmingen er avhengigheten av store polyakrylamidgeler for effektivt å løse fosforylert og ikke-fosforylerte underlag. Protokollen gir spesifikke detaljer om hvordan du kan helle disse store gelene og unngå vanlige fallgruver når du gjør det.
Arbeid med RNA krever spesiell forsiktighet fordi det er sterkt utsatt for nedbrytning. Det er enkle forebyggende skritt man kan ta for å begrense ribonuclease forurensning. En separat RNA-arbeidsstasjon som enkelt kan behandles med et RNase-hemmerholdig rengjøringsmiddel er ofte nyttig. Bruk alltid hansker ved håndtering av prøver og bruk av RNase-frie sertifiserte forbruksvarer er nødvendig. Fordi vann er en annen vanlig forurensningskilde, er det best å bruke nyrenset vann og sterilisere alle løsninger ved hjelp av et 0,22 μm filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet er en analyse for å måle kinaseaktiviteten til Grc3 PNK på fluorescerende merkede nukleotidunderstrater. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere andre PNK enzymer ved å tilpasse reaksjonsbufferen og oligonukleotidsubstratet. Protokollen krever for eksempel et sporbeløp på EDTA. Tilsetning av EDTA er gunstig av to grunner: For det første favoriserer denne tilnærmingen magnesiumbundet Grc3 ved å forhindre at enzymet bindes til spormengder av forurensende metaller i blandingen. For det andre hem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
Referências
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Bioquímica. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
